Сдэк логотип вектор: Логотип СДЭК / Грузоперевозки / TopLogos.ru

31.05.2021 alexxlab

Содержание

СДЭК Пенза ул Центральная 1 к2

Наименование:: Подразделение службы доставки «Экспресс-курьер» (ТК СДЭК, транспортная компания)
Код подразделения:: PNZ2
Адрес:: 440004, Российская Федерация, Пензенская область, г. Пенза, ул. Центральная, д. 1 к2, на карте
Номер телефона:: +7 (8412) 98-98-36
Руководитель:: нет данных
Электронная почта:: [email protected]
Официальный сайт:: www.cdek.ru
Пункт выдачи / приёма:: Есть
Весовые ограничения:: 0 — 30 кг

Офис на карте

Ближайшая остановка: ТЦ «Ритэйл-Парк»
Доехать до остановки ТЦ «Ритэйл-Парк», У входа в гипермаркет «Вектор» с левой стороны

Режим работы

Работает:: Пн. — Пт. — с 10:00 до 20:00
Сб. — Вс. — с 10:00 до 16:00
Без перерыва
Приём и выдача грузов:: Пн.- Вс. — в течение всего рабочего дня

*Рекомендуем перед посещением офиса уточнить по контактным телефонам график приёма

Услуги ПВЗ

Выдача заказов;
Приём отправлений;
Примерочная

Способы оплаты:: 5

Наличные;
Банковские карты;
Наложенный платеж;

Электронные деньги;
Платежные терминалы и банкоматы

Срок хранения заказов:

в пункте выдачи — 7-14 дней (бесплатно)
на складе — до 3-х лет (не востребовано)

Для получения отправления необходимо:

документ удостоверяющий личность (например, паспорт)
10-ти значный номер отправления (содержится в SMS при поступлении заказа в ПВЗ)

Отзывы

Пожалуйста, оставьте небольшой отзыв об этом пункте выдачи. Большое спасибо!

Другие офисы города

Благодаря открытию одного из крупнейших сортировочных центров в Новосибирске СДЭК первой в Сибири начнет предлагать услугу регионального фулфилмента. Заголовок. Новосибирский бизнес портал

Новый сортировочный центр СДЭК открыт на Северном проезде, 3/8 и занимает площадь в 2000 квадратных метров. Здесь обрабатываются отправления, которые приходят из Китая, Москвы, Санкт-Петербурга и Сибири, с Урала и Дальнего Востока. Его запуск позволит компании единственной в Сибири предлагать клиентам услугу фулфилмента, эффективно обрабатывать возрастающий объем посылок, в том числе, в пиковый сезон, обеспечивать круглосуточный режим работы.

Основной причиной для расширения складских мощностей послужило постоянно растущее количество грузов, который перевозит компания. Так, если в 2015 году общий объем отправлений СДЭК составил порядка 6 млн. штук, то в 2016 году эта цифра увеличилась до 11 миллионов штук, что говорит о темпах роста отправлений на уровне 187%.

«Поскольку Новосибирск является одним из ключевых транспортных узлов для СДЭК, в какой-то момент мы поняли, что начинаем работать на пределе своих возможностей. Сейчас у СДЭК появился складской комплекс, который является одним из самых больших для Новосибирска, а его пропускная способность увеличилась, по сравнению со старым центром на Кривощековской, в 5-6 раз. В сутки через сортировочный центр проходит примерно 2000 посылок. Его пропускная способность – порядка 500 000 посылок в месяц», — рассказал директор регионального подразделения СДЭК в Новосибирске Андрей Стариков.

Стариков также отметил, что площади нового сортировочного центра позволяют СДЭК быть единственным логистическим оператором в Сибири, предоставляющим услугу регионального фулфилмента, в том числе для небольших компаний.

С целью ускорения погрузо-разгрузочных работ сортировочный центр СДЭК на Северном проезде оснащен 3 погрузочно-разгрузочными воротами с автоматически регулирующимися доками, которые предназначены для разгрузки любых автомобилей – от «Газелей» до еврофур. Также в помещении предусмотрены ворота на «нулевом» уровне, обеспечивающие попадание внутрь нескольких грузовых автомобилей одновременно. В сутки здесь происходит загрузка и разгрузка 15-25 среднетоннажных машин. Также с открытием складского комплекса удалось снизить время обработки тяжеловесных грузов и снять ограничения по габаритным характеристикам.

В ближайших планах у СДЭК запуск второй курьерской базы на мощностях нового сортировочного центра (первая расположена на Кривощековской). Это даст возможность увеличить время работы курьеров на маршруте до 12 часов (с 9 до 21 часа).

Киров — Доставка и оплата

1. Киров Сурикова_4303_С

Адрес: 610035, Киров г, Сурикова ул, д.19, оф.

117

Режим работы: пн-пт 09-13:30, 14-18, сб 10-13:30, 14-14

2. Киров Октябрьский_4304_С

Адрес: 610005, Киров г, Октябрьский пр-кт, д.87

Режим работы: пн-чт 09-19, пт-пт 09-18, сб 10-15

3. Киров Пятницкая_4307_С

Адрес: 610020, Киров г, Пятницкая ул, д.

Режим работы: пн-пт 09-19, сб 10-15

4. Киров Андрея Упита_4318_С

Адрес: 610050, Киров г, Андрея Упита ул, д.7

Режим работы: пн-пт 12-20, сб 10-14

5. На Московской

Адрес: Россия, Кировская обл. , Киров, ул. Московская (вход с ул. Свободы), 15

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

6. Воровского

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Воровского, 111 Б/5, 4

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

7. Киров Октябрьский_4320_С

Адрес: 610017, Киров г, Октябрьский пр-кт, д.

Режим работы: пн-чт 09-19, пт-пт 09-18, сб 10-15

8. На Блюхера

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Блюхера, 42

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

9. Киров Маклина_4323_С

Адрес: 610017, Киров г, Маклина ул, д. 57

Режим работы: пн-пт 09-20

10. Киров Мостовицкая_4326_С

Адрес: 610025, Киров г, Мостовицкая ул, д.4

Режим работы: пн-вс 10-20

11. Киров Молодой Гвардии_4330_С

Адрес: 610008, Киров г, Молодой Гвардии (Нововятский) ул, д. 8

18. Киров Строителей (Радужный)_4339_С

Адрес: 610010, Киров г, Радужный мкр, Строителей пр-кт, д.9а

21. Молодой Гвардии

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Молодой Гвардии, 100

Режим работы: пн-пт 08-20, сб 10-18

23. На Октябрьском

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Октябрьский пр-т, 11

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

24. Киров Архитектора Валерия Зянкина_4352_С

Адрес: 610037, Киров г, Архитектора Валерия Зянкина ул, д.11/1

26. На Ульяновской

Адрес: Россия, Кировская обл. , Киров, ул. Ульяновская, 30

Режим работы: пн-вс 09-20

27. На Профсоюзной

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Ул. Профсоюзная, 52

Режим работы: пн-вс 09-20

28. ТЦ «АЛЕНКА»

Адрес: Россия, Кировская обл. , Киров, ул. Воровского, 137б

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

36. мкр. Чистые Пруды

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, ул. Мостовицкая, 11

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

38. ЖД Вокзал

Адрес: Россия, Кировская обл. , Киров, ул. Чапаева, 48

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

39. На Красноармейской

Адрес: Россия, Кировская обл., Киров, Ул. Красноармейская, 5

Режим работы: пн-пт 09-20, сб 10-18

40. Нововятский район, ТЦ Вектор

Адрес: Россия, Кировская обл. , Киров, ул. Советская, 49А

Режим работы: пн-пт 10-20, сб 10-18

42. Киров Студенческий_4368_С

Адрес: 610033, Киров г, Студенческий проезд, д.28, павильон 3

Doorhan логотип вектор

Логотип DoorHan (ДорХан) / Строительство и ремонт …

DoorHan DHG018 : Логотип DoorHan для привода SECTIONAL …

️ Логотип DoorHan для привода SE-750/1200 DHG018 в Москве …

Логотип DoorHan для привода SE-750/1200 — купите в .

..

DoorHan Логотип DoorHan для привода SE-750/1200, DHG018 …

Аннотация Эко Леди Логотип Вектор | Скачать

Установленные значки сети недвижимости Логотипы дома …

Испечет логотип. Вектор иллюстрация вектора. иллюстрации …

Логотип Motocross Спорт также вектор иллюстрации притяжки …

Логотип звероловства и шаблон значка Плоский дизайн Вектор …

Логотип обслуживания закона с штендером и авторучкой также …

Испечет логотип. Вектор иллюстрация вектора. иллюстрации …

Золотой логотип письма R металла Вектор дизайна письма R …

Все изображения «Пежо Логотип Вектор» / photo-zhurnal.ru

Гаруда Панкасила Индонезия Вектор, птица и щит логотип png …

Цветущий векторный логотип — Вектор: изображение, рисунок …

Логотип Motocross Спорт также вектор иллюстрации притяжки .

..

Svg Crafteroks руки Eps вектора будильника вычерченное …

Системы передачи логотип вектор — Векторное изображение …

Корона роскошный королевский логотип вектор изображение …

Логотип лист мяты и вектор символа Иллюстрация вектора …

Логотип буквы O — Вектор: изображение, рисунок © UASUMY …

58 номером логотип значок — Стоковий вектор © brainbistro …

Свадебный логотип дизайн шаблона. свадебный логотип вектор …

Логотип сдэк вектор – Логотип СДЭК / Грузоперевозки …

ЛОГОТИП КОФЕ ВЕКТОР — копия | Манакост Hearthstone | Runeterra

Тэги:
Логотип DoorHan ДорХан Строительство и ремонт, DoorHan DHG018 Логотип DoorHan для привода SECTIONAL, Логотип DoorHan для привода SE7501200 DHG018 в Москве, Логотип DoorHan для привода SE7501200 купите в, DoorHan Логотип DoorHan для привода SE7501200 DHG018, Аннотация Эко Леди Логотип Вектор Скачать, Установленные значки сети недвижимости Логотипы дома, Испечет логотип Вектор иллюстрация вектора иллюстрации, Логотип Motocross Спорт также вектор иллюстрации притяжки, Логотип звероловства и шаблон значка Плоский дизайн Вектор, Логотип обслуживания закона с штендером и авторучкой также,

Похожие посты:

Анализ энхансеров перидермы рыбок данио облегчает идентификацию регуляторного варианта, близкого к человеческому KRT8 / 18

Здесь мы предприняли анализ энхансеров перидермы рыбок данио с двумя целями, имеющими отношение к генетическим основам орофациального расщепления. Первым было узнать больше о генной регуляторной сети (GRN), управляющей дифференцировкой перидермы. Уже сейчас человеческие ортологи четырех известных элементов этого GRN, Irf6, Grhl3, Klf17 и простых кератинов эпителия вовлечены в риск несиндромального орофациального расщепления.Следовательно, ортологи дополнительных членов этой GRN, в частности гены в хабах сети, являются кандидатами на то, чтобы нести мутации, которые составляют недостающую наследуемость для орофациального расщепления. Вторая цель заключалась в использовании энхансеров перидермы рыбок данио для обучения классификатора, с помощью которого можно было бы расставлять приоритеты SNP в некодирующей ДНК с учетом их вероятности разрушения энхансеров перидермы. До недавнего времени идентификация энхансеров с заданной специфичностью требовала индивидуального тестирования энхансеров в репортерных анализах.Хроматиновая метка ChIP-seq и ATAC-seq, для которых требуется меньше клеток, позволили идентифицировать кандидаты в энхансеры в определенных тканях или типах клеток в большом количестве (Quillien et al. , 2017; Wilkerson et al., 2019). Однако в настоящее время не существует модели клеточной линии перидермы неба человека. Клетки перидермы могут быть выделены из нёба мышиных эмбриональных полок с использованием клеточной сортировки с активацией флуоресценции (FACS) и линии трансгенных мышей Krt17 -GFP (McGowan and Coulombe, 1998). Однако перидерма рыбок данио гораздо более доступна.В то время как тканеспецифические энхансеры редко бывают сильно консервативными у рыб и млекопитающих, достоверная эффективность тканеспецифических энхансеров рядом с человеческим геном RET в анализах трансгенных репортеров рыбок данио предполагает, что, по крайней мере в некоторых случаях, энхансеры, специфичные для данной ткани, являются состоят из одних и тех же сайтов связывания факторов транскрипции в двух кладах (Fisher et al., 2006a). В конечном итоге мы достигли обеих этих целей.

Для идентификации набора энхансеров, активных в перидерме рыбок данио, мы отсортировали GFP-положительные и GFP-отрицательные клетки из трансгенных эмбрионов Tg (krt4: gfp) через 11 часов после оплодотворения и выполнили ATAC-seq для обеих популяций. Около 5% всех ATAC-seq-положительных элементов имели как минимум в 2 раза больше считываний ATAC-seq в GFP-положительных клетках. Для сравнения: ATAC-seq на GFP-положительных и GFP-отрицательных клетках, отсортированных из Tg (fli1: gfp) эмбрионов рыбок данио через 24 часа после оплодотворения (Quillien et al., 2017), или просенсорных клеток, отсортированных из протоков улитки в . Трансгенные мыши sox2-EGFP (Wilkerson et al., 2019) выявили, что около 9% и 15%, соответственно, всех элементов ATAC-seq имеют большую глубину считывания в GFP-положительных клетках. Различие в доле тканеспецифичных элементов может просто отражать различия в фильтре кратного изменения в чтениях-последовательностях ATAC, применяемом к таким элементам.Менее половины NFR, обогащенных GFP-положительными клетками, были помечены h4K27Ac в лизатах целых эмбрионов примерно на той же стадии (Bogdanovic et al., 2012). Это наблюдение согласуется с другими исследованиями, показывающими, что корреляция между статусом отсутствия нуклеосом и сигналом h4K27Ac не является абсолютной; например, неактивные энхансеры могут быть без нуклеосом (Iwafuchi-Doi et al. , 2016). Гены, фланкирующие элементы, отвечающие обоим критериям, сильно обогащены теми, которые экспрессируются в перидерме. Гены, фланкирующие элементы, удовлетворяющие только первому критерию (больше считываний ATAC-seq в GFP-положительных клетках, чем в GFP-отрицательных клетках), были обогащены аналогичным образом, но в меньшей степени.Periderm-специфические NFR, лишенные h4K27Ac на 8hpf или 24 hpf, но связанные с генами, экспрессируемыми в перидерме, могут быть энхансерами, которые активны на другой стадии; в соответствии с существованием таких элементов, недавнее исследование показывает, что профиль экспрессии в перидерме рыбок данио изменяется со временем (Cokus et al., 2019). Кроме того, 10 из 10 протестированных элементов, отвечающих обоим критериям и проксимальных к генам, о которых известно, что они высоко и специфически экспрессируются в перидерме, функционировали как энхансеры перидермы в анализах репортеров рыбок данио.Вместе эти результаты подтверждают наш вывод о том, что элементы с большим количеством считываний ATAC-seq в GFP-положительных по сравнению с GFP-отрицательными клетками отсортированы из Tg (krt4: gfp) эмбрионов через 11 часов оплодотворения и помечены h4K27Ac через 8 часов оплодотворения и / или 24 часов оплодотворения. , обладают активностью энхансера (или промотора) перидермы у эмбрионов на этих стадиях.

Оценка сайтов связывания транскрипционных факторов, обогащенных пиками ATAC-seq, может дать представление о сетях регуляции транскрипции (Lowe et al., 2019; Miraldi et al., 2019), и это сделано здесь для перидермальной GRN.Во-первых, факторы транскрипции, которые, как известно, связывают мотивы, обогащенные кандидатами в энхансеры перидермы рыбок данио, включают те, которые ранее участвовали в развитии перидермы, такие как Irf6, Grhl3 и Klf17, и новые, включая C / ebp, Fosl, Gata3 и Tead. Интересно, что ортологи (или, в случае Klf17, паралог, Klf4) каждого из этих факторов транскрипции необходимы для развития кожи млекопитающих, показывая сходство соответствующих GRN (например, GRHL [Gordon et al., 2014; Nishino et al. др., 2017], TEAD-YAP (Elbediwy et al., 2016), FOS-JUN / AP-1 (Uluçkan et al., 2015), KLF4 (Segre et al., 1999), TFAP2 (Leask et al., 1991), GATA6 (Yang et al., 2002), C / EBP (Sato et al. , 2012), ETS1 (Chin et al., 2013; Nagarajan et al., 2010), IRF6 [Ingraham et al., 2006]). Роль членов семейства Tead в развитии перидермы подтверждается наблюдением, что мутация потери функции в yap , кодирующая кофактор Tead, нарушает развитие перидермы в medaka (Porazinski et al., 2015). Знание ключевых элементов GRN перидермы может помочь в расстановке приоритетов в вариантах, которые обнаруживаются у пациентов с орофациальным расщеплением при анализе всего экзома или всего генома.Во-вторых, в то время как сайты Irf6 обнаруживаются только у 5% кандидатов в энхансеры, сайты Grhl присутствуют в большинстве. Это означает, что хотя оба этих семейства факторов транскрипции важны для развития перидермы, белки Grhl функционируют гораздо шире, чем их аналоги Irf6. В-третьих, сайт связывания Irf6 был в большей степени обогащен кандидатами в энхансеры, которые были связаны с большим количеством считываний ChIP-seq анти-h4K27Ac через 8 часов после оплодотворения (hpf), чем через 11 часов после оплодотворения. Это означает, что Irf6 действует на ранней стадии GRN; представление о том, что Irf6 активирует программу перидермы и в этом случае больше нет необходимости, согласуется с тем фактом, что мутанты zygotic irf6 жизнеспособны (Li et al., 2017). Наконец, zGPAE, связанные с генами, кодирующими кандидаты в члены GRN, содержат сайты связывания для других таких членов, подразумевая, что взаимная перекрестная регуляция этих факторов транскрипции является обширной. В то время как прямые связи, выведенные таким образом, ждут подтверждения с помощью ChIP-seq или CUT & RUN, перекрестная регуляция между членами данного слоя GRN является общей чертой в разработке (Davidson, 2009). Следует отметить, что данные ATAC-seq могут быть объединены с данными RNA-seq для получения моделей сетей регуляции транскрипции, которые приближаются к более сложным сетевым моделям, полученным с помощью исследований ChIP-seq и нокаута транскрипционных факторов (Miraldi et al., 2019).

Затем мы применили классификатор машинного обучения к кандидатам в энхансеры перидермы рыбок данио и использовали его для проверки предсказания, что энхансеры перидермы рыбок данио обогащены теми же мотивами последовательностей, что и их аналоги из млекопитающих. В то время как машинный классификатор опорных векторов с пробелами был самым эффективным алгоритмом на момент начала исследования, сейчас доступны другие, которые могут работать лучше в некоторых обстоятельствах (Liu et al., 2017b). Обученный классификатор имел низкую частоту ложных срабатываний и кривые auROC и auPR, сопоставимые с таковыми в аналогичных опубликованных исследованиях (Gorkin et al., 2012; Chen et al., 2018). Мы применили gkmSVM к тайлам генома рыбок данио. Построение среднего балла плиток, перекрывающих обучающий набор, и тех, которые не перекрывают, было полезно для передачи потенциала этого инструмента для различения усилителей перидермы на основе одной только последовательности. В среднем плитки, перекрывающие биохимически предсказанные усилители перидермы (т. Е. ZGPAE), имеют более высокие баллы, чем те, которые этого не делают, но графики этих двух распределений перекрываются, что указывает на то, что высокий балл не является гарантией того, что элемент является усилителем перидермы. Мы также применили классификатор к геному человека и обнаружили, что энхансеры в различных типах эпителиальных клеток обогащены для плиток с высокими показателями больше, чем энхансеры других классов. Это предполагает, что эпителиальные энхансеры сконструированы аналогичным образом у этих позвоночных организмов. В некоторых случаях плитки с высокими показателями в геноме человека могут быть ортологами энхансеров перидермы рыбок данио. Примером такого случая может быть плитка с высокими показателями в 8,3 т.п.н. выше гена PPL человека, который, как мы обнаружили, имел детектируемую консервацию последовательности по отношению к GFP-положительному NFR в 10 т.п.н. выше гена рыбок данио ppl .Применение классификатора к геному мыши показало, что плитки с высокими показателями были обогащены рядом с генами, экспрессируемыми в перидерме, что свидетельствует о том, что энхансеры перидермы у рыбок данио и мыши обогащены одними и теми же мотивами последовательностей. Это означает, что энхансеры перидермы человека разделяют эту особенность и поддерживает использование классификатора в deltaSVM-анализе связанных с заболеванием SNP рядом с генами, экспрессируемыми в перидерме.

Наконец, мы использовали классификатор, обученный на zGPAE, для определения приоритета SNP, связанных с орофациальной щелью, около KRT18, гена, экспрессируемого в перидерме, для тех, которые могут влиять на энхансер перидермы.Интересно, что классификаторы, обученные энхансерам, очевидно, селективны для а) перидермы рыбок данио по сравнению с неперидермой, б) эпителия неба мыши по сравнению с мезенхимой неба или в) линии клеток эпителия полости рта человека по сравнению с линией клеток мезенхимы неба человека, все выбранные SNP2 (т. Е. Rs2070875 ) как имеющий самый сильный Delta SVM среди 14 OFC-ассоциированных SNP в этом локусе. Это снова подтверждает представление о том, что эпителиальные энхансеры устроены сходным образом у всех позвоночных. Хотя наборы сайтов связывания обогащенных транскрипционных факторов, обогащенные тремя наборами энхансеров, были сходными, только классификатор, обученный на энхансерах перидермы рыбок данио, дал deltaSVM для SNP2, который соответствовал формальной значимости. Предполагая, что SNP2 действительно функционален, эти результаты показывают, что успех deltaSVM в идентификации функциональных SNP больше зависит от энхансеров, полученных из правильной ткани (т.е. перидермы), чем от правильного вида (т.е. человека).

Является ли SNP2 ассоциированным с орофациальной щелью (OFC) SNP в этом локусе, который непосредственно влияет на риск заболевания? Люциферазные анализы в клетках эпителия ротовой полости человека подтверждают представление о том, что SNP1 и SNP2 лежат в энхансерах, активных в эпителии ротовой полости, и подтверждают предсказания анализа deltaSVM, что SNP2, но не SNP1, влияет на активность энхансера, охватывающего их.Тот факт, что гомозиготная делеция участка 109 п.н., фланкирующего SNP2, снижает экспрессию KRT18 и KRT8, , также поддерживает SNP2, влияющий на риск OFC, поскольку целостность перидермы нарушена у эмбрионов рыбок данио, лишенных нескольких генов кератина (Pei et al., 2007) . Неожиданно эти элементы не были постоянно активными в репортерных анализах, проводимых на эмбрионах рыбок данио и мышей. Однако надежные доказательства хроматиновых меток на человеческих эмбриональных лицах и человеческих эпидермальных кератиноцитах предполагают, что отсутствие усиливающей активности этих элементов в анализах на эмбрионах рыбок данио и мышей отражает технический артефакт; например, возможно, эти энхансеры несовместимы с базальным промотором в векторе GFP (из гена FOS Fisher et al., 2006b) или в векторе LacZ (из гена Shh ). В анализах репортеров эмбрионов рыбок данио энхансеры работают более надежно в сочетании со своими родственными промоторами, чем с экзогенным (Quillien et al., 2017). Интересно, что у одного эмбриона мыши с 8 копиями конструкции трансгена SNP2 экспрессия репортера четко выявлялась во внешней перидерме. Конструкция имела аллель риска SNP2, но поскольку количество репортерных копий варьировалось среди эмбрионов, мы не могли оценить, влияет ли аллель на уровень репортера в этом анализе.Создание эмбрионов с множественными интегрированными копиями конструкций или, возможно, нацеливание конструкций на другой локус, будет необходимо для определения активности энхансера, несущего SNP2, в перидерме полости рта, как можно было бы предсказать, если SNP2 имеет отношение к риску орофациального расщепления. Таким образом, собранные данные подтверждают, что SNP2 влияет на экспрессию энхансера, активного в перидерме, и регулирует экспрессию KRT18 и KRT8 .

В заключение мы предполагаем, что представленные классификаторы могут быть полезны при номинации функциональных SNP в дополнительных локусах, идентифицированных в исследованиях полногеномной ассоциации орофациального расщепления.В локусах, где ген-кандидат экспрессируется в эпителии полости рта, например IRF6, MAFB, FOXE1, TP63 , следует применять классификаторы, обученные zGPAE, mPEAE и hOEAE; если ген риска экспрессируется в базальном эпителии, например TP63 , классификатор, обученный mPEAE, может работать лучше, чем классификатор, обученный zGPAE. Если кандидатный ген риска экспрессируется в мезенхиме (например, PAX7 ), ожидается, что классификатор, обученный mPMAE, будет наиболее точным.Важно отметить, что при исследовании более 100 SNP корреляция между оценками deltaSVM и эффектами SNP на уровне репортера (в соответствующем типе клеток) была значительной, но умеренной (Lee et al. , 2015). Таким образом, анализ машинного обучения может отдавать приоритет SNP, но функциональные тесты остаются важными. Такие тесты включают количественную оценку влияния SNP на активность энхансера либо с помощью репортерных анализов in vitro, либо, что более эффективно, с помощью геномной инженерии соответствующей клеточной линии, чтобы сделать SNP гомозиготным по аллелю риска или без риска, а затем количественное определение уровней РНК. для ближайшего гена, релевантного риску.Эффективность гомологически направленной репарации для этой цели остается сильно зависимой от локуса, и нам не удалось применить ее здесь, хотя мы сделали это в другом локусе (Liu et al., 2017a). К счастью, инструменты редактирования одиночных нуклеотидов быстро улучшаются (Zafra et al., 2018; Anzalone et al., 2019). Наконец, анализы репортеров in vivo будут оставаться важными для тестирования тканевой специфичности энхансеров, несущих функциональные SNP-кандидаты. В таких анализах явно желательна безопасная интеграция хроматина, хотя такие безопасные гавани могут быть более допустимыми для экспрессии в некоторых тканях, чем в других, и совместимость энхансер-промотор может дополнительно влиять на эффективность репортерных анализов in vivo (Quillien et al. , 2017).

Аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов

Введение

Потеря кардиомиоцитов является основной причиной сердечной недостаточности, которая является разрушительным прогрессирующим заболеванием, поражающим более 30 миллионов пациентов во всем мире ¹. Хотя в сердце взрослого млекопитающего происходит ограниченное обновление кардиомиоцитов, этого недостаточно для восстановления сократительной функции после потери кардиомиоцитов, что приводит к кардиомиопатии. ^2–7 Следовательно, стимуляция регенерации кардиомиоцитов является основной целью восстановления сердца при кардиомиопатии.В отличие от некоторых низших позвоночных, которые обладают способностью к регенерации сердца в течение всей жизни ^8–14, кардиомиоциты взрослых млекопитающих навсегда выходят из клеточного цикла вскоре после рождения и обладают очень ограниченным регенеративным потенциалом. Исследования на сердцах новорожденных мышей показали, что апикальная резекция или инфаркт миокарда (ИМ) мышей постнатального дня 1 (P1) приводит к устойчивому регенеративному ответу, однако эта способность теряется P7, что совпадает с остановкой клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов ^{15, 16} На сегодняшний день идентифицировано несколько регуляторов клеточного цикла кардиомиоцитов ^17–23, однако неясно, существуют ли специфические для мышц факторы, которые регулируют митоз кардиомиоцитов.

Плотный миофибриллярный состав кардиомиоцитов представляет собой особую проблему во время митоза, чего нет в других клетках без поперечно-полосатой линии. У взрослого кардиомиоцита саркомеры занимают более 60% цитоплазмы кардиомиоцитов ²⁴ и прикрепляются к плазматической мембране, вызывая деформацию клетки во время сокращения. Важной и интересной особенностью регенерирующего сердца является разборка саркомеров кардиомиоцитов ^15,25,26 и их периферическая маргинализация во время митоза кардиомиоцитов ²⁷.Этот феномен долгое время наблюдался при делении кардиомиоцитов и оказался надежным индикатором митоза кардиомиоцитов в раннем постнатальном сердце ^15,17,22,28 Однако на сегодняшний день механизмы, которые регулируют разборку саркомеров, не изучены. Более того, неясно, играет ли регуляция разборки саркомеров роль в потере регенеративной способности неонатального сердца с увеличением постнатального возраста. В текущем исследовании мы намеревались идентифицировать регуляторы разборки саркомеров кардиомиоцитов во время митоза. Мы обнаружили, что цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является критическим регулятором разборки саркомера.

Результаты

Аддуцин преимущественно экспрессируется во время неонатального регенеративного окна и тесно связан с разборкой саркомера

Иммуноокрашивание регенерирующего сердца новорожденного демонстрирует клиренс цитоплазматического саркомера и локализацию тропонина T (Tnnt2) на периферии кардиомиоцитов 63 63 . Эта ассоциация Tnnt2 с разобранными саркомерами, таким образом, может быть использована для понимания других белков, связанных с разборкой.Поэтому мы сравнили протеомные профили, ассоциированные с Tnnt2, с помощью масс-спектрометрии (MS) после коиммунопреципитации (Co-IP) с антителом Tnnt2 на двух разных стадиях развития; Через 3 дня после инфаркта миокарда (ИМ) на P1 (P1MI), временной точке, связанной с устойчивой пролиферацией кардиомиоцитов, и через 3 дня после ИМ на P7 (P7MI), временной точке, в которой отсутствует митотическая индукция кардиомиоцитов (рис. 1B) ^{15, 16}. Среди 224 идентифицированных белков мы обнаружили, что 80% из них были белками, связанными с цитоскелетом.На рис. 1С перечислены выбранные цитоскелетные или саркомерные белки, идентифицированные с помощью МС. α-спектрин является одним из наиболее распространенных белков в списке образца P1MI, но мало экспрессируется в образце P7MI. Мы также обнаружили, что α- и γ-аддуцин по-разному ассоциированы с Tnnt2 во время регенеративного окна. Хотя оба белка были слабо обнаружены с помощью MS, они были обнаружены только в образце P1MI. Предыдущие исследования немышечных клеток показали, что аддуцин регулирует взаимодействие спектрина с актином с образованием решетки для механической поддержки плазматических мембран. Известно, что аддуцин является последующим эффектором нескольких сигнальных путей, как важный регулятор, контролирующий взаимодействия спектрина. , актин и другие белки цитоскелета и мембран в эритроцитах ³⁰, эндотелиальных клетках ^31,32 и центральной нервной системе ³³, однако почти ничего не известно о его функции в мышечных клетках или кардиомиоцитах. Аддуцин имеет три изоформы, α-аддуцин (ADD1), β-аддуцин (ADD2) и γ-аддуцин (ADD3), которые кодируются разными генами, но имеют очень гомологичные домены головы, шеи и хвоста ³⁴. Аддуцины образуют гетеродимеры за счет взаимодействия в головном домене α- / β- или α- / γ-аддуцина. α- / γ-Аддуцин повсеместно экспрессируется во всех тканях, тогда как β-аддуцин ограничен эритроцитами или клетками мозга ³⁵. Затем подтягивание альфа-аддуцина с помощью Tnnt2 было подтверждено с помощью обратного Co-IP, в котором антитело Add1 использовалось в качестве приманки, а полученные в результате белки были обнаружены с помощью антитела Tnnt2 (рис.1D). Ассоциация аддуцина с саркомерным белком α-актинином также была подтверждена Co-IP и WB (рис. 1D). Исследование экспрессии эндогенного белка аддуцина с помощью WB показало, что экспрессия как α-, так и γ-аддуцина снижалась с увеличением постнатального возраста (рис. 1E). Затем мы исследовали с помощью иммуногистохимии характер экспрессии α-аддуцина, γ-аддуцина, α-спектрина и α-филамина, которые были 4 из самых популярных результатов на скрининге MS (рис. 1F). Мы обнаружили, что аддуцин и спектрин только совместно локализовались с разобранным саркомером в пролиферирующих кардиомиоцитах, где они были связаны с мембранозной и субмембранозной областями.α-Филамин показал заметную картину окрашивания ядер в непролиферативных клетках и слабую цитоплазматическую картину в пролиферативных клетках. Эти результаты подтверждают связь аддуцина с пролиферирующими кардиомиоцитами в сердце новорожденного.

Рис. 1. Идентификация аддуцина как ключевого белка, связанного с разборкой саркомера.

A. Схема показывает морфологию разборки саркомера. B. Схема Co-IP / MS по TNNT2. C. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с TNNT2, идентифицированные с помощью Co-IP / MS.* PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к белку. *** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. D. Коиммунопреципитация ADD1 из всех экстрактов сердца в точках P1 и P7, исследованная на TNNT2 и α-актинин. E. (слева) Представитель WB для демонстрации профиля эндогенной экспрессии ADD1 и ADD3 в разном возрасте. (Справа) Количественная оценка уровня экспрессии аддуцина относительно внутреннего контроля GAPDH. (n = 3 в группе). F. Экспрессия четырех выбранных цитоскелетных белков по результатам MS, α-, γ-аддуцин, спектрин и филамин были окрашены в сердцах новорожденных, показывая профиль пролиферации (слева) и непролиферации (справа) кардиомиоцитов. Стрелки указывают на репрезентативные ячейки. Стрелки на изображениях, окрашенных филамином, относятся к расположению ядра.Масштабная линейка = 10 мкм.

Сверхэкспрессия изоформы 2 α-аддуцина может разбирать саркомеры у ювенильных животных

Альтернативный сплайсинг является важной посттранскрипционной регуляцией в генах, специфичных для мышц ^36,37. Он также играет важную роль в развитии сердца и кардиомиопатии ^38–40. До сих пор почти все публикации об α-аддуцине были сосредоточены на варианте 1, который кодирует полноразмерный Add1. Согласно информации от Ensembl, Add1 имеет 15 вариантов сплайсинга, в результате чего образуются две основные изоформы, изоформа 1 и 2.Их различие заключается в экспрессии экзона 15, который имеет стоп-кодон в рамке считывания (рис. 2A, верх). Следовательно, включение экзона 15 будет транскрибировать вариант 2, который кодирует более короткую изоформу 2, лишенную ~ 100 аминокислот на С-конце. С другой стороны, транскрипция с исключением экзона 15 будет давать полноразмерную изоформу 1 α-аддуцина (рис. 2A внизу). Мы исследовали уровень эндогенной экспрессии изоформы 2 в сердце в разном возрасте с помощью WB (рис. 2Б). Мы обнаружили, что уровни экспрессии изоформы 2 следовали той же схеме, что и изоформа 1, где она также снижается с постнатальным возрастом в сердце мыши.Чтобы выяснить потенциальную роль Add1 в разборке саркомеров в кардиомиоцитах, мы создали конструкции для экспрессии изоформы 1 (Add1 i1) и 2 (Add1 i2) WT индивидуально и упаковали их в аденоассоциированный вирус (AAV). Мы использовали кардиотропный AAV6, несущий различные изоформы в миоцитах желудочка новорожденных крыс (NRVM) (рис. 2C), чтобы определить влияние экспрессии аддуцина на разборку саркомера. AAV6-GFP был включен в качестве контроля. Очищенные вирусы использовали для заражения культивируемых NRVM с титром 5 × 10 ⁴ генома вектора на клетку (vg / клетку) в течение 72 часов до фиксации.Чтобы количественно оценить степень разборки саркомера, мы заранее определили три типа паттернов; саркомеры в собранном, частично разобранном и полностью разобранном виде. Частично разобранный саркомер относится к миоцитам с любыми видимыми саркомерами, тогда как полностью разобранный саркомер — это миоциты без каких-либо саркомеров. Мы обнаружили, что 61,9% NRVM со сверхэкспрессией Add1 i1 показали частично разобранные саркомеры (рис. 2C-i), в то время как 10,8% положительных клеток Add1 i1 показывают полностью разобранные саркомеры, где саркомеры не были обнаружены (рис.2C-ii). Сверхэкспрессия с помощью Add1 i2 приводила к частичной дизассемблированию 49,1% и полной разборке на 50,8% (рис. 2C iii, iv). Эти результаты показывают, что избыточная экспрессия Add1 i2 более эффективна в индукции разборки саркомера, чем Add1 i1. Затем мы попытались создать кардиоспецифичную трансгенную (TG) модель, в которой экспрессия Add1 i2 управляется промотором α-MHC (Fig. 2D Top). Трансгенные мыши Add1i2 не показали значительных различий в размере и морфологии сердца по окрашиванию H&E (рис. 2D внизу слева) или HW / BW (рис.2D внизу справа). Когда мы сравнивали паттерн сверхэкспрессии аддуцина на P14 и P28, мы отметили относительное снижение Add1 на P28 по сравнению с сердцами P14 (рис. 2E). Важно отметить, что мы обнаружили, что сердца P14 демонстрировали признаки разборки саркомера, а сердца P28 — нет (рис. 2F). Оценка систолической функции левого желудочка с помощью эхокардиографии не показала какой-либо заметной разницы между WT и Add1i2 TG сердцами (рис. S1A). Наконец, мы наблюдали значительное увеличение ph4-положительных кардиомиоцитов Add1i2 TG на p14 (рис.S1B) без изменения размера кардиомиоцитов (рис. S1C). Эти результаты подтверждают, что специфическая для кардиомиоцитов избыточная экспрессия Add1 i2 вызывает временное усиление разборки саркомеров, которое не сохраняется до взрослого возраста.

Рис. 2. Сверхэкспрессия изоформы 2 Add1 разрушает саркомеры кардиомиоцитов.

A. (вверху) Схема экзонов и интронов гена Add1 . Красный прямоугольник представляет экзон 15, который является целью альтернативного сплайсинга. (Внизу) Схема показывает включение или исключение экзона 15 в событиях альтернативного сплайсинга мРНК.Соответствующая схема транслируемого белка показана рядом с мРНК. Включение экзона 15 имеет код остановки в рамке считывания, который генерирует изоформу 2 ADD1, составляющую 636 аминокислот (а.о.). Исключение экзона 15 транслируется в изоформу 1 ADD1, составляющую 732 а.о. B. Вестерн-блоттинг показывает эндогенный профиль изоформы 2 ADD1 в разном возрасте. GAPDH используется в качестве внутреннего контроля. C. Типичные изображения NRVM, трансдуцированные с помощью AAV6-Add1i1 (i, ii), AAV6-Add1i2 (iii, iv) и AAV6-GFP (v) на 3-й день.Схемы кассет экспрессии AAV показаны с изображениями каждой группы. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали α-актинином (ACTN2, красный) для выявления саркомерной организации. Зеленая флуоресценция представляет собой либо изоформу аддуцина 1 и 2, либо GFP. Справа показаны изображения квадратичных областей с большим увеличением. Пунктирными линиями обозначена граница кардиомиоцитов. (i) и (iii) представляют собой частично разобранные саркомеры. (ii) и (iv) представляют собой полностью разобранные саркомеры. (v) представляет собранные саркомеры.Процент изменений сборки саркомера с помощью AAV показан на графике. D. (вверху) Схема, показывающая стратегию создания отдельной трансгенной линии изоформы 2 Add1. (Внизу слева) H&E окрашивание WT и кардиоспецифичных трансгенов Add1 i2. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Соотношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных трансгенных Add1i2. E. (вверху) Изображения, показывающие паттерн экспрессии трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображение квадрата области с большим увеличением на верхних панелях.Масштабная линейка = 10 мкм. F. (вверху) Репрезентативные изображения, показывающие образец саркомера трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. Врезки — изображения одиночных кардиомиоцитов (области в квадрате) с большим увеличением. Пунктирными линиями нанесены внешние и внутренние границы саркомеров. (Внизу) График количественной оценки, показывающий степень разборки саркомера. Оценки разборки были определены как: (внешняя область — внутренняя область) / внешняя область. Соответствующие по возрасту матки помета мышей WT использовали в качестве контроля. На P14 трансгенные мыши ADD1 i2 имеют значительно более тонкую саркомерную зону с центральным клиренсом по сравнению с контролем.Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t .

Роль фосфорилирования α-аддуцина в митозе кардиомиоцитов новорожденных

Несколько фосфо-сайтов аддуцина, которые регулируют паттерны дифференциальной экспрессии, были идентифицированы ранее. Чтобы понять, участвует ли фосфорилирование аддуцина в регуляции разборки саркомера кардиомиоцитов, мы исследовали паттерн эндогенной экспрессии фосфо-изоформ α-аддуцина в сердце новорожденных мышей (рис.3А). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование α-аддуцина по Thr445 и Thr480 в шейном домене усиливает рекрутирование спектрина на F-actin ³¹. Окрашивание неонатальных сердец антителом против фосфо-Thr455 показало локализацию в клеточной коре только в миоцитах с разобранным саркомером (стрелки), но в ядре кардиомиоцитов нераспространения (стрелки). Также сообщалось, что α-аддуцин фосфорилируется циклин-зависимой киназой 1 (CDK1) по Ser12 и Ser355 в головном домене, чтобы связываться с митотическими веретенами ³².Мы обнаружили, что митотические кардиомиоциты демонстрируют колокализацию Ser355 в цитоплазме митотических кардиомиоцитов (стрелка). В других исследованиях сообщалось, что Ser716 и Ser726 (S714 и S724 у мыши соответственно) расположены в C-концевом миристоилированном домене, связанном с богатым аланином субстратом С-киназы (MARCKS), и являются субстратами для протеинкиназ A (PKA) и C ( PKC). Фосфорилирование этого домена ингибирует рекрутирование спектрина на актиновые филаменты и вызывает разборку сети спектрин-F-актин ⁴¹.Наши результаты показывают, что фосфорилирование S724 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных in vivo. Кроме того, аддуцин может фосфорилироваться PKA по Ser408, Ser436 и Ser481, что ингибирует его связывание с комплексом спектрин-F-актин ⁴². Мы обнаружили, что фосфорилирование S724 или S481 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных. Мы также исследовали корреляцию экспрессии фосфо-аддуцина со стадией клеточного цикла кардиомиоцитов как in vitro, и in vivo. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом pT445 в NRVM (рис.3B) и сердце P4 (фиг. S2A) подтвердили корреляцию экспрессии аддуцина с митозом кардиомиоцитов. В профазе pT445, по-видимому, является ядерным, тогда как в прометафазе с инициацией разборки аддуцин pT445 экспрессируется как в цитоплазме, так и в митотической хромосоме. Экспрессия аддуцина остается цитоплазматической через телофазу. WB паттерна экспрессии аддуцина фосфо-T445 указывает на то, что его экспрессия снижается с возрастом, что соответствует тому же паттерну WT Add1 (фиг. 3C). Этот паттерн экспрессии фосфо-аддуцина T445 / T480 во время митоза кардиомиоцитов предполагает, что фосфорилирование T445 и T480 может играть важную роль в разборке саркомеров.

Рис. 3. Роль фосфомиметика Add1 i1 при разборке саркомера.

A. Паттерн экспрессии эндогенного фосфоаддуцина в сердце новорожденных мышей. Схема расположения фосфозита показана слева. Справа: изображения иммуноокрашивания показывают изображения совместного окрашивания антител к фосфоцентрам с саркомерным белком TNNT2 или α-актинином. Сверху вниз расположены фосфо-сайты T445 / T480, S12 / S355, S714 / S724 и S408 / S436 / S481. Стрелки указывают фосфо-аддуцин, совместно локализованный с разобранными саркомерами.Стрелки указывают на совместную локализацию с собранными саркомерами. B. Эндогенная экспрессия фосфоаддуцина T445 в NRVM, окрашенная α-актинином (красный), антифосфоаддуцином pT445 (зеленый) и DAPI. Фосфо-аддуцин перемещается из ядра в цитоплазму во время митоза. C. (вверху): исследование WB уровня экспрессии эндогенного фосфо-T445. (Внизу) Количественная оценка уровня экспрессии pT445 относительно уровня экспрессии ADD1. D. Избыточная экспрессия аддуцина фосфо- или нефосфомиметика T445 / T480 в NRVM, индуцированная AAV6.(Вверху слева). Схематическая диаграмма челночного вектора AAV показывает, что мутанты аддуцина экспрессируются с 3 тандемными эпитопами FLAG в рамке считывания на N-конце. (Внизу слева) Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом к α-актинину для выявления саркомерной структуры. Мутанты аддуцина выявляются антителами Flag в зеленом цвете. Справа показаны изображения репрезентативной области с большим увеличением (белый прямоугольник). Пунктирные линии были нарисованы вокруг границы камеры. (Справа) Количественный анализ разобранных саркомеров, индуцированных сверхэкспрессией аддуцина.Масштабная линейка = 10 мкм. E. (вверху). Схемы, демонстрирующие стратегию создания кардиоспецифичного индуцибельного отдельного трансгенного фосфора Add1 i1 (p-TRE T445E / T480E, α-MHC tTA). (Внизу слева) H&E окрашивание контрольного и кардиоспецифического трансгенного фосфата Add1 i1. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Соотношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных фосфо-одиночных трансгенных животных. F. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного фосфо-Add1i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображения с большим увеличением селективных кардиомиоцитов, имитирующих гиперэкспрессию фосфо-аддуцина.На P14 мы видели фосфо-мимические экспрессии как в цитоплазме, так и на мембране (внизу слева). На P28 фосфо-мимический аддуцин экспрессируется на мембране и в ядре (внизу справа). Масштабная линейка = 10 мкм. G. (слева) Репрезентативные изображения, демонстрирующие структуру саркомера трансгенного фосфо-ADD1 i1 на P14 и P28. Вставки представляют собой изображения одиночного кардиомиоцита с большим увеличением. Пунктирными линиями проведены по внешнему и внутреннему краям кардиомиоцитов. (Справа) Количественный график, показывающий разборку саркомера.Оценки разборки определяли так же, как и у трансгенного Add1i2 на фиг. 2F. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм. Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t . Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t .

Чтобы определить, влияет ли избыточная экспрессия фосфорилированного аддуцина в кардиомиоцитах на разборку саркомера, мы сконструировали серию мутантов аддуцина, имитирующих фосфорилированный и нефосфорилированный аддуцин посредством сайт-направленного мутагенеза (фосфо-мимического и фосфо-молчащего).Замена на Glu имитирует форму фосфорилирования аддуцина, в то время как мутация на Ala имитирует нефосфорилированную форму. В конструкции дополнительно упаковывали вспомогательную плазмиду для получения рекомбинантного вируса AAV6. Морфологию саркомера исследовали путем окрашивания антителом к α-актинину и совместной локализации с FLAG-положительными клетками. Наши результаты демонстрируют, что почти 60% Add1-положительных кардиомиоцитов с фосфомиметической сверхэкспрессией (T445E / T480E) демонстрируют полную разборку саркомера по сравнению с кардиомиоцитами, инфицированными фосфо-молчащей формой (T445A / 480A), что в основном индуцировало частичную разборку саркомера (рис.3D). Мы также создали фосфо-мимические и фосфо-молчащие мутанты фосфо-сайтов S12 / S355 и S714 / S724. Заражение NRVM AAV6, несущим эти фосфомутанты, не показало значительного увеличения полной разборки саркомера (рис. S2B и S2C), хотя фосфо-молчащая форма S714 / S724 действительно показала более высокие показатели полной разборки по сравнению с фосфо-мутантами. мимическая форма. Поэтому мы сосредоточились на фосфо-сайтах T445 / T480, чтобы изучить их роль в разборке саркомеров.

Чтобы определить, может ли форсированная экспрессия конститутивно активной мембранно-ассоциированной формы Add1 вызывать разборку саркомера in vivo, мы создали индуцибельную линию трансгенных (TG) мышей pTRE-T445E / T480E, в которой фосфоизоформа аддуцин избирательно экспрессируется в кардиомиоцитах только после скрещивания с мышью αMHC-tTA и отмены доксициклина (Tet-off) (рис.3E). Трансгенные животные не показали значительных изменений в размере сердца или HW / BW на P28 (рис. 3E). Подобно вышеупомянутой одиночной трансгенной линии Add1 i2, мы обнаружили, что положительные по фосфо-аддуцину кардиомиоциты имели неоднородный паттерн экспрессии, и мы наблюдали снижение экспрессии от P14 до P28 (фиг. 3F, верх). Дальнейшее изучение саркомерного паттерна в фосфо-мимических положительных кардиомиоцитах показало цитоплазматическую экспрессию аддуцина с разборкой саркомера на P14, которая не сохранялась до кардиомиоцитов P28, которые показали нормальные саркомерные структуры (рис.3F внизу). Оценка разборки подтвердила, что хотя кардиомиоциты были разобраны на P14, они имели нормальную морфологию на P28 (рис. 3G), что напоминает паттерн, который мы отметили ранее с Add1i2 TG (рис. 2F). Это указывает на то, что избыточная экспрессия Add1 i2 или фосфомиметика Add1 i1 помогает расширить окно разборки саркомера, но не поддерживает этот паттерн до взрослого возраста. Хотя мы обнаружили сигналы ph4 в сердцах на P14, существенной разницы по сравнению с контролем нет (рис.S3A). Размер кардиомиоцитов также не отличается на P14 (рис. S3B).

Для стабилизации белка требуется сопутствующая экспрессия α- и γ-аддуцинов

Предыдущие отчеты в основном были сосредоточены на α-аддуцине, в первую очередь потому, что он считается ограничивающим фактором в образовании гетеродимера с γ- или β-аддуцином или даже с α-аддуцином. гомодимер сам с собой ⁴³. Это предположение подтверждается элегантными исследованиями на моделях Add1 KO, которые предположили, что делеция α-аддуцина приводит к значительному снижению экспрессии γ-аддуцина.Однако в наших исследованиях невозможность разобрать саркомер в обоих одиночных Add1 TG после P14 поднимает важный вопрос: нужен ли γ-аддуцин для функции α-аддуцина in vivo? В наших исследованиях профиль эндогенной экспрессии аддуцинов показал, что экспрессия γ-аддуцина становится незначительной на P14 (рис. 1E). Это может указывать на то, что одиночные линии TG Add1 теряют способность разбирать саркомеры за пределами P14 вторично по отношению к возрастной потере Add3. Чтобы оценить стабильность Add1 по отношению к Add3, мы выполнили in vitro трансфекцию с помощью Add1 var.1 и вар. 2 при наличии или отсутствии Add3. Чтобы избежать перекрестной реакции антител к аддуцину между α-аддуцином и γ-аддуцином, мы трансфицировали клетки вариантами Add1 с тремя тандемными тегами FLAG на N-конце и / или плазмидами Add3 с тремя тандемными тегами TY1 на N-конце. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Мы собирали клетки в нескольких точках времени после обработки и исследовали уровни белка с помощью WB. Интересно, что мы обнаружили, что как α-аддуцин i1, так и i2 становятся нестабильными после обработки CHX в отсутствие γ-аддуцина.Однако в присутствии γ-аддуцина стабильность изоформ α-аддуцина 1 и 2 значительно повышалась. (Рис. 4A). Этот результат указывает на то, что неспособность отдельных трансгенных линий вызывать выраженную разборку за пределами P14 может быть связана с отсутствием эндогенного γ-аддуцина в более поздние моменты времени.

Рисунок 4. Коэкспрессия изоформы 2 Add1 вместе с Add3 повышает стабильность аддуцина.

A. Клетки HEK293T подвергали трансфекции варианта 1 (p-3xFlag-Add1i1) и варианта 2 Add1 (p-3xFlag-Add1i2) в присутствии или в отсутствие Add3 (p-3xTy1-Add3).Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки. (Слева) WB для отображения уровня белка. (Справа) Измерение относительного уровня белка ADD1i1 или Add1i2 (рассчитанного как FLAG по сравнению с GAPDH) в отсутствие или в присутствии ADD3. Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием одностороннего теста t . Б. Схематическая диаграмма, показывающая конструкции для создания двойных трансгенных Add1 i2 и Add3. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. C. Результаты QPCR, показывающие уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. D. (слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. E. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). n = 3 для каждой группы. F. Продольные виды, демонстрирующие структуру саркомеров двухмесячного дикого животного и двойного трансгенного аддуцина (низкая экспрессия). Изображения с большим увеличением области в рамке на изображении с низким увеличением показаны справа. Пунктирными линиями обозначена граница, на которой экспрессируется аддуцин. На вставке показаны саркомеры в частично разобранном виде (неорганизованные, но не отсутствующие саркомеры).Соответствующая экспрессия аддуцина указана стрелками. Масштабная линейка = 10 мкм. G. Результаты QPCR, показывающие уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. H. (Слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. I. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 в возрасте 1 месяца (высокая экспрессия).(n = 3 для каждой группы). J. (вверху) Репрезентативные изображения, показывающие структуру саркомеров у двойных трансгенных клеток ADD1 i2 / ADD3 возрастом 1 месяц (высокая экспрессия). (Внизу) Увеличенные изображения Вставки из панелей сверху. K. (Слева) Двойной трансгенный ADD1 i2 / ADD3 с высокой экспрессией имеет свидетельства фрагментации кардиомиоцитов. (Справа) Большое увеличение области слева. Стрелки указывают на фрагменты саркомера, в которых совместно локализованы ADD1 и TNNT2. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм.Данные представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t .

Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали линию мышей с двойными трансгенными клетками (dTG), коэкспрессирующими ген Add1 варианта 2 и ген Add3. Эта линия была получена путем инъекции двух независимых кассет экспрессии вместе (фиг. 4B). Из 35 учредителей 11 были положительными dTG. Иммуноокрашивание с помощью Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в кардиомиоцитах (рис.S4A). Основываясь на результатах qPCR уровней экспрессии Add1 i2, мы разделили линии на две группы в зависимости от уровня экспрессии (рис. 4C). Здесь важно отметить, что уровни эндогенной экспрессии Add1i2 на исходном уровне не обнаруживаются после P14, поэтому трансгенные линии показывают высокий уровень относительной экспрессии мРНК в сравнении.

Сначала мы исследовали линии с более низким уровнем экспрессии (dTG-L). Мы обнаружили, что морфология сердца и HW / BW в 2-месячном возрасте были аналогичны WT (рис.4D — репрезентативная нижняя линия выражения). Однако систолическая функция ЛЖ у мышей dTG-L была немного ниже, чем у WT (рис. 4E). Интересно, что мы обнаружили, что саркомерные структуры демонстрировали частичную разборку в кардиомиоцитах, если аддуцин был сверхэкспрессирован (Рис. 4F). Эта морфология выглядела как дезорганизованные саркомеры без четких полос (рис. 4F). Однако мы не наблюдали классической схемы разборки саркомера с зазором саркомера. Затем мы исследовали фенотип группы с высокой экспрессией аддуцина (dTG-H).Уровень мРНК группы с высокой экспрессией dTG-H был примерно в 1,6 раза выше, чем в группе с низкой экспрессией (фиг. 4G-репрезентативная линия с более высокой экспрессией). Срезы сердца с dTG-H в возрасте двух месяцев показали расширение желудочков (рис. 4H, слева) и повышенное соотношение HW / BW (рис. 4H, справа). Эхокардиография показала заметно сниженную систолическую функцию ЛЖ с фракцией выброса левого желудочка (ФВЛЖ) 56% (рис. 4I). Мы наблюдали некоторую частичную разборку с фокальной локализацией TNNT2 на вставленном диске (рис.4J), хотя некоторые миоциты не демонстрировали значительной дезорганизации саркомеров (нижний ряд рис. 4J). Мы также наблюдали разрушение и фрагментацию кардиомиоцитов, что свидетельствует об увеличении гибели клеток (рис. 4K). что было дополнительно подтверждено тестом TdT-опосредованного мечения ник-концов dUTP (TUNEL) (рис. S4B). Затем мы оценили размер кардиомиоцитов с помощью окрашивания WGA и обнаружили, что dTG-H имеет значительно высокий процент малых кардиомиоцитов, более низкий процент кардиомиоцитов среднего размера и аналогичный процент крупных кардиомиоцитов (рис.S4C). Эти результаты показывают, что сопутствующая экспрессия Add3 и Add1 стабилизирует аддуциновый комплекс и что как dTG-L, так и dTG-H демонстрируют частичную разборку саркомера, при этом dTG-H демонстрирует доказательства широко распространенной гибели кардиомиоцитов и подавления функции ЛЖ.

Генерация двойной трансгенной мыши с фосфо-аддуцином Add1 / Add3 Модель

Как отмечалось ранее, фосфо-одиночный TG T445E / T480E демонстрирует разрушение саркомера в сердце новорожденного, но не во взрослом сердце (рис. 3G), вероятно, из-за отсутствия Выражение Add3 во взрослом сердце.Учитывая улучшенную разборку кардиомиоцитов новорожденных с форсированной экспрессией фосфо-T445E / T480E, мы интегрировали дизайн фосфомиметического трансгенного с Add1i2 / Add3 dTG для создания нового кардиоспецифичного двойного трансгена, который коэкспрессирует фосфомиметик Add1 i2 T445E / T480E и WT Add3 (p-dTG) (рис. 5A вверху). Окрашивание H&E сердец этих мышей продемонстрировало, что взрослые сердца p-dTG больше, чем WT (фиг. 5A внизу), что было подтверждено измерением HW / BW (фиг. 5B). ФВЛЖ была умеренно снижена у двухмесячных мышей, хотя существенно не изменилась у более молодых мышей (рис.5С). Изучение уровня мРНК аддуцина с помощью кПЦР подтвердило повышенный уровень экспрессии pAdd1i2 по сравнению с данными WT (фиг. 5D). Иммуноокрашивание Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. S5A). Затем мы исследовали структуру саркомера путем окрашивания тропонином на P7, P14, P21 и через 2 месяца. Результаты демонстрируют, что кардиомиоциты p-dTG демонстрируют разобранные саркомеры, которые были очевидны во все моменты времени (рис. 5E I, ii, iii и iv), хотя разборка кажется более выраженной на ранних стадиях новорожденности.Фактически, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, была локализована в зоне, окружающей ядра и на периферии кардиомиоцитов, с полным очищением саркомеров в этих зонах. Исследование митотических маркеров кардиомиоцитов этих сердец продемонстрировало увеличение количества кардиомиоцитов, положительных по киназе ph4 и aurora B, как на P21, так и через 2 месяца (рис. S5B и C), без изменения размера клеток (рис. S5D) или нуклеации (рис. . S5E).

Рисунок 5. Фосфомимический двойной трансген способствует разборке саркомера.

A. (вверху) Схематическая диаграмма конструкций для создания двойных трансгенных фосфомиметиков Add1 i2 и Add3. Замена Glu на T445 и T480 имитирует фосфорилированную форму Add1 i2. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. (Внизу) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных фосфо-Add1 i2 / Add3. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. B. Отношение массы сердца к массе тела у WT и фосфо-двойных трансгенных животных на Р21 день и 2 месяца.(n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). C. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у P21 и двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). (n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). D. QPCR уровня мРНК Add1i2 у двухмесячных фосфо-двойных трансгенных клеток. E. Саркомерный образец двойных фосфо-трансгенных трансгенных клеток в точках P7 (i), P14 (ii), P21 (iii) и в возрасте 2 месяцев (iv). Изображения с большим увеличением области в рамке показаны справа от уменьшенного изображения.Пунктирные линии обводят границу, где аддуцин выражается вне саркомеров. Стрелки относятся к регионам с высоким уровнем экспрессии аддуцина. Обратите внимание на очистку саркомеров, в которых экспрессируется аддуцин. Масштабная линейка = 10 мкм. F. Крупномасштабный скрининговый анализ киназ выявил 7 кандидатов, которые потенциально фосфорилируют сайты T445 (слева) и T480 (справа). Скорректированные значения активности киназы (исходное значение минус образец пептидного фона, в имп / мин) с образцом пептида при одной концентрации в анализах пептидкиназы 245 Ser / Thr.Синий: киназа с образцом пептида; желтый: активность киназы без образца пептида. G. Анализ совпадения серин / треониновых киназ для проверки 3 киназ, NEK1, DCAM1 и IRAK4, выбранных из начального скринингового анализа киназ. Каждую киназу тестировали при трех концентрациях в трех повторностях. Эти результаты предполагают, что все киназы NEK1, DCAMKL2, IRAK4 демонстрируют зависящую от концентрации способность фосфорилировать образец пептида «T445» и «T480». H. Подтверждение паттерна эндогенной экспрессии IRAK4 (слева) и NEK1 (справа) в регенерирующем сердце новорожденных.Положительные сигналы обозначены стрелкой. I. (вверху) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV6. Сверхэкспрессия IRAK4 (зеленый) в NRVM вызывает разборку саркомера (окрашенного α-актинином, красный цвет) (i) и аддуцина pT445 (окрашенного pT445, красный цвет), перемещаемого из ядра в цитоплазму (ii). Стрелки указывают на то, что аддуцин экспрессируется в ядрах IRAK4-отрицательных клеток. Масштабная линейка = 10 мкм. J. (вверху слева) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV9. (Вверху справа) Схематическое изображение экспериментальной конструкции.(Внизу) AAV9-IRAK4-GFP вводили детенышам CD1 на P1, а сердца собирали на P15 для разделения и окрашивания. Сверхэкспрессия IRAK4 вызвала сильную разборку саркомеров (i) в кардиомиоцитах по сравнению с контролем из однопометников (ii).

Идентификация киназ, которые опосредуют фосфорилирование аддуцина в кардиомиоцитах

Учитывая критическую роль, которую фосфорилирование T445 / T480 играет в разборке саркомера, мы попытались определить механизм этого события фосфорилирования. Чтобы идентифицировать киназы, которые опосредуют фосфорилирование ассоциированных с мембраной сайтов T445 и T480, мы выполнили анализ киназного скрининга 245 киназ на фосфо-сайты T445 и T480.Первоначальный скрининг выявил семь потенциальных киназ с относительно высокими значениями активности по сравнению с фоном для фосфо-сайта T450 (таблица S1, фиг. 5F слева). Пептид T480 показал значительный ответ только на киназу VRK1 (рис. 5F справа). Затем мы выполнили вторичный скрининг для основных совпадений, описанных выше, с использованием анализа зависимости реакции от дозы HitConfirmation ™. Эти исследования подтвердили активность только трех киназ, а именно киназы 1, связанной с NIMA (NEK1), киназы 4, связанной с рецептором интерлейкина 1 (IRAK4), а также даблкортин-подобной и CAM-киназы 2 (DCAMKL2), которые проявляют зависимое от концентрации фосфорилирование T445 фосфозит (рис.5G). Эти киназы также показали увеличение доза-ответ на T480, хотя это оказалось менее заметным, чем у пептида T445. Эндогенное окрашивание кандидатов в киназы на сердце P4 подтвердило, что как IRAK4, так и NEK1 продемонстрировали четкую совместную локализацию с разобранными саркомерами (фиг. 5H).

Чтобы определить роль IRAK4 в индукции разборки саркомеров, мы создали конструкции IRAK4-AAV6 для сверхэкспрессии IRAK4 в кардиомиоцитах новорожденных in vitro. Интересно, что сверхэкспрессия IRAK4 привела к разборке саркомера (рис.5I, верхняя панель), что было связано с экспрессией фосфорилированного аддуцина pT445 в цитоплазме IRAK4-положительных клеток (нижняя панель). В IRAK4-отрицательных клетках аддуцин экспрессировался только в ядре (рис. 5I, нижняя панель со стрелками). Сверхэкспрессия NEK1 в NRVM не оказывала какого-либо явного влияния на саркомеры или фосфорилирование аддуцина (данные не показаны).

Для оценки структурных изменений саркомера при сверхэкспрессии IRAK4 in vivo, мы создали вирус AAV9-IRAK4.Мы вводили этот вирус в сердца новорожденных мышей в точке P1 и собирали сердца в точке P15, момент времени, значительно превышающий выход из клеточного цикла кардиомиоцитов новорожденных. Иммуноокрашивание срезов сердца продемонстрировало, что клетки со сверхэкспрессией IRAK4 демонстрировали заметную разборку саркомеров (фиг. 5J). Эти результаты показывают, что IRAK4 фосфорилирует аддуцин in vitro и in vivo и вызывает разборку саркомера. В совокупности наши результаты идентифицируют гетеродимер аддуцина в качестве важного регулятора разборки саркомера кардиомиоцитов во время митоза кардиомиоцитов

Идентификация партнеров по связыванию комплекса аддуцина в регенеративных и нерегенеративных временных точках

Наши результаты до сих пор предполагают, что фосфорилированный гетеродимер аддуцина опосредует разборку кардиомиоцитов. .Однако, учитывая, что аддуцины ранее не исследовались на сократительных клетках, партнеры связывания аддуцина в кардиомиоцитах неизвестны. Чтобы идентифицировать белки, которые взаимодействуют с аддуцином в кардиомиоцитах, мы выполнили MS-анализ экстрактов сердечных белков P1 и P7 с использованием антитела ADD1 в качестве приманки (стратегия, аналогичная фигуре 1A, но с использованием антитела ADD1 вместо антитела Tnnt2). Мы обнаружили, что многочисленные мишени, которые были идентифицированы с помощью начального анализа Tnnt2 с понижением, также были обнаружены с использованием α-аддуцина (рис.6A), предполагая, что α-аддуцин связывается с саркомерными белками в раннем постнатальном сердце.

Рисунок 6. Анализ Co-IP / MS с очищенным комплексом аддуцина.

A. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с ADD1, идентифицированные с помощью Co-IP / MS. * PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности фрагментных ионов в каждом спектре, относящемся к конкретному белку.*** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. Масштабная линейка = 10 мкм. В . Схема процесса очистки коротких и длинных комплексов аддуцина. C. Схематический рисунок показывает блок-схему Co-IP / MS с помощью раскрывающегося списка очищенного комплекса аддуцина. D. Гистограмма для канонических путей, обогащенных каждым образцом. Ось X показывает преобразованное скорректированное значение p (процедура Бенджамини-Хохберга) перекрытия между белками образца и путями.FDR означает частоту ложного обнаружения. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t . E. Сетевой график белков цитоскелета из анализа методом pull down взаимодействует с adducin_long или adducin_short в разные моменты времени (P1 и P21). Различная цветовая маркировка, выделяющая общие и уникальные белки среди групп образцов. Красный цвет представляет четыре группы образцов в выпадающем анализе. Желтым цветом обозначены белки, общие для всех групп.Зеленый цвет обозначает белки, общие только для двух или трех групп. Синий представляет белки, уникальные для каждой группы. F. Анализ близости лигирования (PLA) для изучения прямого взаимодействия между аддуцином (pT445) и саркомерными белками (α-актинин 2) в ткани сердца P4. Красные точки (стрелки) — это флуоресцентные сигналы, указывающие на тесное взаимодействие между двумя антигенами. Образцы включают взаимодействие между α-актинином и тропонином Т (в качестве положительного контроля) или фосфо-аддуцином (pT445) и α-актинином. Масштабная линейка = 10 мкм. G. Иммуно-ЭМ изображение, показывающее внутриклеточное расположение фосфо-аддуцина в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами в сердцах новорожденных после инфаркта миокарда на 3-й день после операции. Два красных прямоугольника на левом изображении увеличены справа. (i) аддуцин локализован на z-дисках. (ii) фосфо-аддуцин в значительной степени локализован на z-дисках, связанных с плазматической мембраной в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами. Красные стрелки указывают местонахождение аддуцина.

Поскольку аддуцин действует как дуплекс (α / y в кардиомиоцитах), использование антитела ADD1 в качестве приманки может не повторить его характер связывания.Кроме того, хотя вышеупомянутое исследование на основе антител может работать в сердце новорожденного, отсутствие значимой экспрессии аддуцина в сердце взрослого человека не позволяет провести это исследование у взрослых. Чтобы лучше понять, почему даже в dTG-сердцах разборка сердец, по-видимому, более выражена у новорожденных по сравнению со взрослыми кардиомиоцитами, мы провели исследование с использованием очищенного комплекса α / γ-аддуцина в качестве приманки с экстрактами сердца P1 или P21. Мы клонировали оба гена Add1 и Add3 в плазмиду pETDuet, которая совместно экспрессирует две ORF вместе и естественным образом образует дуплекс в клетках.6xHis-метку клонировали на N-конце Add1 для облегчения очистки и анализа с пониженным содержанием. Чтобы определить, связывает ли длинная (ADD1i1 / ADD3) и короткая (ADD1 i2 / ADD3) формы аддуцина саркомерные белки по-разному во время регенеративного окна по сравнению с более поздними временными точками, мы создали две плазмиды для ко-экспрессии ADD1i1 / ADD3 (длинная форма) или ADD1i2 / ADD3 (краткая форма) соответственно. Очищенные белки инкубировали с лизатами сердца в течение ночи, затем связывали с гранулами Ni-NTA, чтобы аддуцин и связанные белки прикреплялись к смоле.Мы также включили отрицательный контроль, в котором лизаты сердца были смешаны с гранулами Ni-NTA. Фиг. 6B и представляют собой схемы очистки белка и Co-IP с использованием очищенного белкового комплекса в качестве приманки. Затем образцы и соответствующие им контроли анализировали масс-спектрометрией в форме log2 (образец / контроль) для расчета кратного изменения. Изменения складок более 1,5 учитывались для дальнейшего анализа пути изобретательности. Фиг.6D представляет собой гистограмму статистически значимых канонических путей, обогащенных образцом.Интересно, что единственный путь с усиленной регуляцией на P1 по сравнению с P21 — это сигнальный путь актинового цитоскелета (два других пути, связанных с митохондриями, были подавлены на P1 по сравнению с P21). Мы также создали сетевой график, чтобы показать, как белки сигнального пути цитоскелета взаимодействуют с длинными или короткими аддуцинами в разные постнатальные моменты времени (P1 и P21) (рис. 6E). Мы также обнаружили, что как длинная, так и короткая формы аддуцина связывают исключительно специфические саркомерные белки в сердце P1, но не в P21.В частности, мы обнаружили, что комплекс аддуцина связывает сердечный актинин (ACTN2) только в сердце P1, но не в сердце P21. Оглядываясь назад, возможно, это не должно было вызывать удивления, учитывая, что актинины являются каркасными белками, которые принадлежат к суперсемейству спектринов ⁴⁴, а спектрин является известным партнером по связыванию аддуцинов в неконтрактильных клетках. В кардиомиоцитах альфа-актинин локализован на Z-дисках, где он важен для регуляции саркомерной организации актина и сборки саркомера.Следовательно, потенциальное взаимодействие между аддуцином и альфа-актинином может быть механизмом разборки саркомера во время митоза кардиомиоцитов. Чтобы оценить взаимодействие между аддуцином и α-актинином2, мы выполнили анализ лигирования методом близости (PLA) (Duolink®, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (рис. 6F) с использованием антитела против фосфо T445 в сердце новорожденного. В качестве положительного контроля мы использовали связывание TNNT2 с α-актинином 2 в анализе PLA. Или результаты показывают, что аддуцин pT445 больше ассоциируется с ACTN2 in vivo в сердце новорожденного.Кроме того, мы использовали электронную микроскопию Immunogold (Immuno-EM) для определения субклеточной локализации аддуцина pT445 в неонатальных кардиомиоцитах с разобранными саркомерами, что продемонстрировало, что аддуцин локализуется на z-дисках саркомеров (где также находится альфа-актинин локализованный) (рис. 6 Ги). Аддуцин pT445 также, по-видимому, связан с разобранными саркомерами в клеточной коре в ассоциации с плазматической мембраной (рис. 6Gii).

Обсуждение

В последние годы многочисленные исследования выявили механизмы регуляции клеточного цикла кардиомиоцитов.Эти механизмы включают различные пути, включая прямые регуляторы клеточного цикла, факторы транскрипции, микро РНК, Lnc-РНК, а также немиоцитарные факторы, включая, среди прочего, внеклеточные матричные, иммунологические факторы и факторы окружающей среды. Однако специфические для поперечно-полосатых мышц механизмы, которые регулируют организацию саркомеров во время митоза кардиомиоцитов, остаются плохо изученными. В текущем отчете мы демонстрируем, что белок цитоскелета аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов.В неконтрактильных клетках предыдущие исследования идентифицировали механизмы, которые регулируют сборку цитоскелета и димеризацию актиновых листов. Напр., Цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является основным регулятором связывания актина и взаимодействия актин-спектрин ^29,30. Семейство аддуцинов состоит из 3 членов, а именно α-, β- или γ-аддуцинов. Полностью собранный аддуцин состоит из гетеродимеров гомологичных альфа- и бета- или гамма-субъединиц. Несмотря на известную роль аддуцина в сборке актина в неконтрактильных клетках, его роль в сократительных клетках полностью неизвестна.

Наши результаты основаны на протеомном скрининге белков, которые дифференциально связываются с TNNT2 в момент ранней регенерации сердца новорожденной мыши. Хотя некоторые белки цитоскелета, по-видимому, по-разному связаны с TNNT2 в этот ранний момент времени, мы сосредоточились на аддуцине, учитывая его известную регулирующую роль цитоскелета в неконтрактильных клетках. Мы приводим несколько линий доказательств, подтверждающих связь аддуцина с саркомерными белками; Во-первых, иммуноокрашивание демонстрирует, что α-аддуцин локализован в цитоплазме и мембране только в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами.Во-вторых, CoIP с использованием антитела ADD1 или очищенного комплекса α / γ-аддуцина предполагает возможную ассоциацию аддуцина с саркомерными белками, в частности α-актинином. В-третьих, мы идентифицировали ассоциированную с мембраной фосфо-изоформу Add1, которая связывает α-актинин с помощью анализа близости лигирования и колокализуется с ассоциированными с мембраной саркомерами с помощью иммуно-электронной микроскопии, меченных частицами нанозолота. Эти результаты показывают, что Add1 является цитоскелетным белком, связанным с саркомером, в кардиомиоцитах.

Важно отметить увеличение количества функциональных исследований in vitro и in vivo, демонстрирующих, что форсированная экспрессия аддуцина вызывает разборку саркомера.Мы показали, что экспрессия нескольких изоформ аддуцина вызывает разборку саркомеров в первичных неонатальных кардиомиоцитах в культуре. Кроме того, как одиночный фосфомимик TG Add1 i2, так и Add1 i1 проявляют негомогенный паттерн экспрессии, который приводит к расширению окна разборки саркомера до P14, но не до зрелого возраста. Анализы стабильности белков продемонстрировали, что совместная экспрессия Add1 или Add3 необходима для стабильности обоих белков, и это было подтверждено in vivo на линиях dTG, которые демонстрировали стабильную экспрессию в зрелом возрасте.Мы также демонстрируем, что, хотя нефосфомимические линии dTG демонстрируют стойкую экспрессию аддуцина, это не привело к выраженной разборке саркомера, в то время как та же конструкция dTG с конститутивно активным фосфомимиком T445 / T480 привела к разборке саркомера, которая сохранялась до взрослой жизни.

Одним из важных ограничений текущих результатов является неполная разборка, которую мы наблюдали во взрослых кардиомиоцитах даже в фосфо-мимических dTG. Хотя мы отметили полную разборку в раннем постнатальном периоде, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, локализовалась в зоне, окружающей ядра, и на периферии кардиомиоцитов с полным очищением саркомеров в этих зонах.Эта частичная разборка, вероятно, объясняет отсутствие заметного снижения систолической функции ЛЖ в этой линии ТГ. Механизм этого дифференциального эффекта аддуцина на раннем постнатальном периоде по сравнению со взрослыми саркомерами неясен, но может быть связан с изменениями фенотипа саркомеров с возрастом. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали очищенный белковый комплекс альфа (короткая или длинная изоформа) -гамма-аддуцин для выявления партнеров по связыванию в сердце ранних новорожденных и подростков. Результаты демонстрируют, что комплекс аддуцина по-разному связывается с белками цитоскелета в зависимости от постнатального возраста.В частности, как короткие, так и длинные формы аддуцинового комплекса, по-видимому, избирательно связываются со специфическим для сердца α-актинином (ACTN2) в сердцах P1, но не P21. PLA и иммуноголд-EM подтверждают мнение, что аддуцин ассоциируется с α-актинином в z-дисках. Хотя ранее не было показано, что аддуцин связывает α-актинин, α-актинин принадлежит к суперсемейству спектринов, а спектрин является известным партнером по связыванию аддуцина в неконтрактильных клетках. Учитывая известную роль α-актинина в прикреплении актина к z-дискам кардиомиоцитов, будущие исследования должны изучить потенциальную роль α-актинина в регуляции разборки саркомеров ниже аддуцина.В совокупности эти результаты идентифицируют важный регуляторный механизм разборки саркомеров, который связывает организацию цитоскелета с регуляцией клеточного цикла в кардиомиоцитах млекопитающих и дает представление о проблемах митоза в активно сократительных клетках.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Все протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Во всех экспериментах использовались как самцы, так и самки мышей, чтобы гарантировать соответствие возраста и пола.Здоровых мышей выбирали случайным образом из колонии для всех экспериментов. Мышей CD1 использовали для гистологических исследований дикого типа с окрашиванием и инъекциями AAV9. Количество животных, используемых для каждого эксперимента, составляло от 3 до 5.

Коиммунопреципитация (Co-IP) и масс-спектроскопия (MS)

Сердца мыши из двух разных точек времени регенерации (n = 3 для каждой), через 3 дня после Инфаркт миокарда (MI) на P1 (P1MI) и через 3 дня после MI на P7 (P7MI) собирали и лизировали в буфере для лизиса IP: 2.5 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 5% глицерин. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась постоянно. 5 мкг мышиного моноклонального антитела TNNT2 (Thermo Scientific) использовали для связывания с 1 мг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. К смеси добавляли гранулы агарозы с белком A (Calbiochem) и продолжали инкубацию при осторожном покачивании в течение 3 часов при 4 ° C. После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки пять раз промывали 1 мл буфера для лизиса IP.Конечные осадки ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов 2XSDS и наносили на гель SDS-PAGE (4-20%). Когда образцы входили в растворяющийся гель примерно на 5-10 мм, анализ останавливали и гель окрашивали кумасси синим. Окрашенную область разрезали и нарезали кубиками размером 1 мм. Затем образцы подвергали масс-спектрометрическому анализу для идентификации белка. Ко-IP с антителом к аддуцину (H-10, номер по каталогу sc-25731 Santa Cruz) проводили с использованием того же протокола.

Гистология и иммуноокрашивание

Ткани сердца фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) / PBS в течение ночи при комнатной температуре, а затем обрабатывали либо для парафина, либо для криогенной заливки.Окрашивание H&E проводили в соответствии со стандартными процедурами в центре гистологии UTSW на парафиновых срезах. Для криозакрепления фиксированные ткани инкубировали в 30% сахарозе / PBS при 4 ° C до погружения тканей. Ткани помещали в замораживающую среду, замораживали при -80 ° C и готовили для криосрезов. Иммуноокрашивание проводили согласно предыдущему описанию ⁴⁵. Вкратце, после извлечения антигена срезы пермеабилизировали и блокировали 10% сывороткой / 0,3% Triton-X100 / PBS в течение 20 минут при комнатной температуре.Затем образцы инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами. Разведения первичных антител и вторичных антител (ThermoFisher) при инкубации варьировались в зависимости от экспериментов. После промывки PBS срезы окрашивали DAPI (ThermoFisher D1306) и устанавливали с помощью VECTASHIELD (Vector Laboratories h2700) для визуализации.

Антитела

Первичные антитела: антитела к тропонину Т, сердечная изоформа Ab-1, клон 13-11 (Thermo Scientific MS-295-P1, 1: 100), антисаркомерный α-актинин (Abcam ab68167), анти- фосфогистон h4 Ser10 (Millipore 06-570, 1: 100), антитело против α-аддуцина (1B1, банк гибридных исследований развития, 1:50, для рисунка 1F), антитело против α-спектрина (3A9, гибридома исследований развития Банк, 1:50, для Фигуры 1F), антитело против Филамина 1 (E-3, sc-17749, Санта-Крус, 1: 100, для Фигуры 1F), антитело против α-аддуцина (фосфо T445) (Santa Cruz sc16738 , для WB и окрашивания, 1: 100), N-концевое антитело против α-аддуцина (Abcam ab151474, для Add1i2 WB и TG), антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100 sc-25731, для WT WB мыши и окрашивание на трансгенном pTRE-Add1 T445 / T480E, 1: 100), антитело против Y-аддуцина (Santa Cruz sc-365177, клон G-2, для WB и окрашивания, 1: 100), анти-α-аддуцин (фосфо S726) антитело (Abcam ab53093, 1: 100.Обратите внимание, что фосфозит S726 у человека расположен на 724 у мыши. Поэтому мы использовали S724, относящийся к этому сайту в статье), антитело против α-аддуцина фосфо S355 (Abmart 20592-1NB-3 / C63-S, 1: 100, для WB и двойных трансгенных), антитело против FLAG (M2 , F3165, Sigma-Aldrich 1: 100). Антитело легкой цепи миозина 2 (ptglab, 10906-1-AP, для окрашивания), антитело против MYH6 (Sigma-Aldrich, HPA001349).

Imaging

Флуоресцентные изображения тканей или клеток были получены с помощью Leica DM2000, Nikon Eclipse Ni микроскопа или конфокального микроскопа Nikon A1R и обработаны с помощью Photoshop CS3 для создания объединенных изображений с разными цветами.Для подсчета размера клеток кардиомиоцитов изображения образцов, окрашенных WGA, анализировали с помощью программного обеспечения Fiji.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг выполняли с использованием стандартных протоколов. Антитела, используемые в WB, представляют собой антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100, sc-25731, 1: 500), антитело против γ-аддуцина (Santa Cruz H-60, sc-25733, 1: 500), -FLAG-антитело (Genescript # A00187, 1: 3000), антитело против Ty1 (Diagenode, # C15200054, 1: 3000) и пероксидаза AffiniPure осла против кроличьего IgG (Jackson ImmunoResearch 711-035-152, 1: 20 000), пероксидаза IgG козы антимыши AffiniPure (Jackson ImmunoResearch 115-035-003, 1: 20 000) были обработаны LI-COR.

Выделение желудочковых миоцитов новорожденных крыс (NRVM) и культура клеток

Кардиомиоциты были выделены из левого желудочка 1-2-дневных крыс Sprague-Dawley в соответствии с протоколом из набора для изоляции (Cellutron Life Technologies, кат. 6031). Затем миоциты высевали на покровные стекла, покрытые ламинином (Life tech # 23017-015) при плотности 1250 клеток / мм в среде DMEM: M199 (3: 1), содержащей 10% лошадиной сыворотки, 5% FBS и 1% пенициллина / Стрептомицин. 100 мкмоль / л 5’-бром-2’-дезоксиуридина включен для подавления роста фибробластов.Через 24 часа после прикрепления клеток замените питательную среду.

Выделение кардиомиоцитов

Выделение кардиомиоцитов из сердец взрослых мышей было описано ранее (Mahmoud et al., 2013). Вкратце, взрослые сердца были взяты только что без предсердий. Образцы фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C. Ножницы разрезают область аорты для лучшего проникновения. После непродолжительной промывки в PBS для удаления PFA сердца инкубировали со свежей коллагеназой D (2,4 мг / мл, Roche) и B (1,8 мг / мл, Roche) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина в течение 12 часов при 37 ° C, используя встряхиватель встряхивающий.Супернатанты собирали и хранили при 4 ° C. После нескольких циклов переваривания до исчезновения видимой ткани супернатанты объединяли и фильтровали через фильтр с нейлоновой сеткой 160 мкм. Конечные клетки собирали центрифугированием при 1000 об / мин в течение 5 минут. Осадки клеток ресуспендировали в свежем PBS с добавлением 1% P / S. Для подсчета нуклеации по меньшей мере 300 кардиомиоцитов на образец были определены количественно с помощью конфокальной визуализации z-стека.

Плазмиды и мутагенез

Вариант 1 транскрипта кДНК мыши Add1 был приобретен у Origene (№ по каталогу MR210357).Ген Add1 амплифицировали и субклонировали в pUC19 для точечных мутаций с помощью набора GeneArt Site-Directed Mutagenesis Plus (Life Technologies, номер по каталогу A14604). Вариант 2 Add1 был клонирован из кДНК библиотеки кДНК мыши P1 Mouse Irak4. был куплен у Ориджена (MR207322). Праймеры, используемые для создания сайт-направленного мутагенеза или других клонов, перечислены в приложениях.

Производство и очистка рекомбинантных векторов AAV

Плазмиды pTR-GNP для создания кассеты экспрессии AAV, pDP6rs и pDG9 для упаковки AAV6 и AAV9 соответственно являются подарками от Dr.Роджер Хаджар (Медицинская школа Маунт-Синай, Нью-Йорк). Мы использовали безвирусную систему упаковки AAV на основе двух плазмид для производства вирусов. Вирусы были продуцированы полиэтиленимином (Polysciences, Warrington, PA) -опосредованной трансфекцией в клетки HEK293T (эмбриональная почка человека, ATCC, # CRL-11268, Manassas, VA). После трансфекции в течение 72 часов клетки собирали центрифугированием. После трех циклов замораживания и оттаивания лизаты клеток обрабатывали универсальной нуклеазой Pierce для лизиса клеток (Pierce, Waltham, MA).Неочищенные вирусные суспензии подвергали двум циклам центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола. Конечные концентрированные вирусы диализовали против PBS и титровали количественной ПЦР в реальном времени.

Культура клеток, трансфекция и обработка циклогексимидом

Клетки HEK293T трансфецировали p-3xFlag-Add1i1 и p-3xFlag-Add1i2 в присутствии или в отсутствие плазмиды p-3xTy1-Add3. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки.Белки экстрагировали и измеряли концентрацию. 10 мкг общих белков разделяли с помощью SDS-PAGE и позже переносили на нитроцеллюлозную мембрану для WB. Антитело против FLAG использовали для обнаружения экспрессии α-аддуцина. Антитело против Ty1 использовали для обнаружения экспрессии γ-аддуцина. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля.

Получение трансгенных мышей

ORF конститутивно активной формы Add1i1 (T445 / T480E) субклонировали в вектор ДНК pTRE-Tight для создания плазмиды pTRE-T445 / T480E.pTRE-T445 / T480E линеаризовали с помощью PvuI и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты полученным трансгенным мышам с использованием стандартных процедур ¹⁷. Чтобы вызвать сверхэкспрессию Add1 в кардиомиоцитах, мышей pTRE-T445 / T480E скрещивали с мышами αMHC-tTA. Мышей соответствующего возраста αMHC-tTA использовали в качестве контроля. кДНК Add1 i2 синтезировали непосредственно из сердца мыши P1 CD-1. Область ORF была субклонирована в вектор на основе pBluescript, промотор которого был заменен промотором αMHC для специфической экспрессии в кардиомиоцитах ⁴⁶.Плазмиду αMHC-Add1i2 линеаризовали с помощью EcoRV и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты созданным трансгенным мышам. Трансгенных мышей скрестили с C57B6N / J. кДНК Add3 была приобретена у Genecript (GenScript Bioteh, NJ). ORF была субклонирована в тот же вектор, что и αMHC-Add1i2. Для создания двойных трансгенных образцов Add1i2 / Add3 линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты с использованием стандартных процедур. Для создания двойного трансгенного фосфо-аддуцина мутантный Add1 i2 T445E / T480E субклонировали под промотором αMHC.Линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 T445E / T480E и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты. И двойные трансгенные, и фосфо-двойные трансгенные были скрещены с C57B6N / J для стратегии разведения.

Иммуно-электронная микроскопия

Чтобы пометить антитело аддуцина нанозолотыми частицами, мы использовали золотое мечение антитела альфа-аддуцина фосфо-Т445. Процедура маркировки следовала протоколу J.R.Thorpe ⁴⁷.

Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay (Duolink, # DUO92101, Sigma) выполняли в соответствии с инструкциями.Циросрезы, полученные через 3 дня после образцов P1MI, использовали для всех исследований. Этапы извлечения антигена и пермеабилизации были такими же, как и при стандартной процедуре иммуноокрашивания. Первичные антитела TNNT2 и α-актинин использовали в качестве положительного контроля.

TUNEL Assay

Криосрезы окрашивали на тропонин Т, как указано выше в разделе «Гистология и иммуноокрашивание». После инкубации с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 555 (Invitrogen), окрашивание TUNEL проводили в соответствии с рекомендациями производителя (набор для определения гибели клеток in-situ, Fluorescein, Roche).Все окрашивание проводили на 3 сердцах на группу, по 3 среза на сердце.

Скрининг-анализ серина / треонина

Мы синтезировали два биотинилированных пептида с сайтами фосфорилирования в середине последовательностей. Они предназначены для «T445», KQQREK T RWLHSG и «T480», EDGHR T STSAVP (символы, отмеченные красным, являются сайтами фосфорилирования). Скрининговый анализ киназ проводился ProQinase GmbH (Фрайбург, Германия). Первоначальный скрининговый анализ определяли при концентрации 1 мкМ в одном экземпляре в радиометрическом анализе (анализ активности PanQinase® ³³) на панели 245 Ser / Thr-киназ с использованием планшетов FlashPlate® PLUS, покрытых стрептавидином (PerkinElmer, Бостон, Массачусетс).Реакционные смеси вносили пипеткой в 96-луночные V-образные полипропиленовые микротитровальные планшеты. Каждый аналитический планшет содержит одну лунку, в которой нет фермента и которая используется в качестве фона. Для оценки результатов параллельно определяли фоновый сигнал каждой киназы (без биотинилированного пептида). Для анализа подтверждения совпадения семь киназ, выбранных из первого скринингового анализа, тестировали с образцами пептидов в трех повторностях при трех концентрациях (1, 0,5, 0,25 мкМ).

Экспрессия и очистка белка

Полноразмерная изоформа 1 ADD1 мыши и ADD3 или ADD мыши! Изоформа 2 и ADD3 были субклонированы в первую и вторую открытую рамку считывания (ORF) вектора pETDuet соответственно.mADD1 имеет метку 6xHis на своем N-конце, за которой следует сайт узнавания протеазы TEV, и плазмида была трансформирована в клетки Rosetta (DE3) pLysS (Novagen). Целевой белок экспрессировали в культурах, выращенных в среде для аутоиндукции при 18 ° C в течение ночи ⁴⁸. Культуру собирали и лизировали через French Press в буфере для лизиса (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT и с добавлением ингибиторов протеаз). Лизат центрифугировали и супернатант наносили на аффинную колонку Ni-NTA (Qiagen).Белки элюировали элюирующим буфером (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT и 250 мМ имидазол (pH 8,0)). Элюат дополнительно очищали ионообменной хроматографией (HiTrapSP) с последующей гель-фильтрационной хроматографией (GF_Superose6). Пиковые фракции собирали и концентрировали до 2-3 мг / мл для последующих экспериментов.

Co-IP очищенного аддуцина 1/3

Очищенный дуплекс аддуцина длинной формы ADD1 i1 / ADD3 и короткой формы дуплекса ADD1 i2 / ADD3 использовали в качестве приманки в анализе методом вытягивания вниз.Свежие сердца P1 и P21 лизировали в IP-буфере: 50 мМ Nah3PO4, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась всегда. 2 мкг очищенного дуплекса аддуцина (короткого или длинного) использовали для связывания с 800 мкг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. Гранулы агарозы Ni-NTA промывали 3 раза буфером для лизиса. Затем в смесь добавили шарики. Инкубацию продолжали при осторожном покачивании в течение 1 часа при 4 ° C.После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки 5 раз промывали 1 мл IP-буфера для лизиса. Буфер для лизиса IP был дополнен 5 мМ иммидазолом в первые 3 раза; с 20 мМ имидазолом последние 2 раза. Гранулы Ni-NTA, связывающиеся с лизатами сердца P1 или P21 при 4 ° C, 1 час были включены в качестве отрицательного контроля. Конечные осадки ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов 2XSDS и наносили на гель SDS-PAGE (4-20%). Когда образцы входили в растворяющийся гель примерно на 5-10 мм, анализ останавливали и гель окрашивали кумасси синим.Окрашенную область разрезали и нарезали кубиками размером 1 мм. Затем образцы подвергаются анализу с масс-спектрометрией для идентификации белков.

Эндорибонуклеаза коронавируса Nsp15 взаимодействует с белком-супрессором опухоли ретинобластомы

ВВЕДЕНИЕ

Коронавирусы могут вызывать заболевания у людей, включая тяжелый острый респираторный синдром (SARS), летальность которого во время вспышки 2002–2003 гг. Составляла ~ 10% ( 17, 37). Коронавирусы также представляют интерес своими геномами с положительной цепью размером ~ 30 т.п.н. и новыми механизмами экспрессии и обработки этой большой РНК (12, 22, 25).Все известные представители семейства нидовирусов, в которое входят коронавирусы, кодируют эндорибонуклеазу, за исключением вируса Нам Динь (33). Рекомбинантная эндорибонуклеаза SARS-CoV (Nsp15) расщепляет РНК сразу на 3 ‘уридилатов. Эта активность стимулируется Mn ²⁺, но не другими двухвалентными металлами, такими как Mg ²⁺ (2). Кроме того, расщепление происходит за счет образования 2′-3′-циклического фосфодиэфирного продукта по механизму, аналогичному механизму РНКазы A (4). Сообщалось о кристаллических структурах SARS-CoV и вируса гепатита мышей (MHV) Nsp15, и оба белка образуют гексамеры в растворе (3, 36, 42).

Мутации в активном центре Nsp15, которые, по-видимому, устраняют активность эндорибонуклеазы in vitro , снижают вирусную инфекционность до 2 log (20, 35). Однако сообщается, что некоторые мутации за пределами активного сайта имеют большее влияние на жизнеспособность вируса, что позволяет предположить, что Nsp15 играет роль (-ы) в коронавирусной инфекции, помимо своей функции как эндорибонуклеазы (18, 20). Кроме того, SARS-CoV Nsp15 был идентифицирован при скрининге вирусных белков, которые могут подавлять апоптоз, демонстрируя, что SARS-CoV Nsp15 может влиять на процессы в клетке-хозяине (24).

Чтобы лучше понять роль SARS-CoV Nsp15 в вирусной инфекции, мы провели поиск мотивов в sNsp15 и определили диагностическую последовательность белков, которые могут связывать белок ретинобластомы (pRb). Этот мотив был первоначально идентифицирован в онкопротеинах, кодируемых ДНК опухолевых вирусов, которые могут секвестировать pRb и предотвращать репрессию генов, необходимых для репликации ДНК (5, 10, 11, 41). Также известно, что некоторые РНК-вирусы взаимодействуют с pRb. Вирус гепатита C (HCV) может подавлять pRb и усиливать прогрессирование клеточного цикла (27).Интересно, что РНК-зависимая РНК-полимераза HCV NS5B связывает pRb и нацеливает ее на убиквитинирование и протеасомную деградацию (27, 28). Аналогичный механизм имеет и вирус кори (30). Также было показано, что белок вируса краснухи Nsp90 взаимодействует с pRb (1) и влияет на репликацию вируса (13). Хотя РНК-вирусы не требуют механизма репликации ДНК хозяина, их взаимодействие с pRb может приводить к изменению метаболического состояния клетки и влиять на вирусную инфекцию (31, 34, 38).

В настоящем исследовании мы изучили функциональную значимость идентифицированного мотива связывания pRb (LXCXE / D) на Nsp15 и изучили влияние Nsp15 на pRb и его функции. Кроме того, мы исследовали значение pRb и его взаимодействие с Nsp15 для инфекции MHV в культивируемых клетках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и вирусы. Клетки DBT, полученные из опухоли головного мозга мыши, поддерживали при 37 ° C с 5% CO. ₂ в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% бычьей телячьей сыворотки (HyClone, Логан, штат Юта; каталожный №Ш40072.03). Клетки почек-21 детенышей хомячка, экспрессирующие рецептор MHV (BHK-R), выращивали в минимальной необходимой среде с добавлением 10% бычьей телячьей сыворотки, 10% триптозофосфатного бульона и G418 (800 мкг / мл). Клетки фибробластов мыши (L2) выращивали в среде DMEM с добавлением 10% бычьей телячьей сыворотки и поддерживали при 37 ° C и 3% CO ₂. Клетки NIH 3T3 выращивали при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ в среде DMEM с 4 мМ l-глутамина, 1,5 г бикарбоната натрия / л и 4,5 г глюкозы (Американская коллекция типовых культур; номер в каталоге.30-2002) / литр и 10% телячьей сыворотки. MHV A59 и мутантные производные размножались в клеточной линии DBT. Клетки 293T и Huh-7 поддерживали при 37 ° C и 5% CO ₂ в 10% бычьей телячьей сыворотке, содержащей, соответственно, высокоглюкозную среду DMEM с GlutaMAX (Invitrogen, Inc.; каталожный номер 10569) и низкую глюкозу. DMEM (Invitrogen, Inc .; каталожный номер 11855).

Очистка белка. Белки дикого типа (WT) и мутантные белки Nsp15, содержащие метку His ₆ на соответствующих N-концах, были экспрессированы в штамме Escherichia coli Rosetta (DE3) pLys и очищены с помощью аффинной хроматографии с ионами металлов с последующей Mono-Q и колонка для гель-фильтрации, как описано ранее (2).Очищенные белки хранили в 50 мМ Трис (pH 7,9) –300 мМ NaCl – 1 мМ дитиотреитол (DTT) –50% (об. / Об.) Глицерине при –20 ° C. PRb _AB (охватывающий домены AB pRb; аминокислоты от 380 до 787) был экспрессирован в виде слияния глутатиона S -трансферазы (GST) в клетках E. coli BL21 (DE3). Индукцию проводили при 22 ° C в течение 16 ч. Белок очищали из клеточного лизата, полученного обработкой ультразвуком в 1 × фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 10 мМ β-меркаптоэтанола. Лизат пропускали через аффинную колонку глутатион-сефароза 4 Fast Flow (GE Healthcare), и белок элюировали тромбином рестрикционного качества (Novagen).Элюированные фракции далее пропускали через колонку для гель-фильтрации Superdex 200 10/300 GL (Pharmacia), уравновешенную буфером (10 мМ Трис [pH 7,5], 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 5 мМ DTT). Концентрации белка определяли по поглощению при 280 нм, и аликвоты очищенного белка хранили в том же буфере при -80 ° C.

Анализ эндорибонуклеазы Nsp15. Субстрат, используемый в этом анализе, имеет длину четыре нуклеотида и содержит 5′-флуорофор карбоксифлуоресцеин (FAM) и 3′-тетраметилродамин, который гасит флуоресценцию FAM (Integrated DNA Technologies), когда субстрат не поврежден.Родственный нуклеотид представляет собой рибонуклеотид, а три других — дезоксирибонуклеотиды. Флуоресценцию, высвобождаемую при инкубации очищенного белка Nsp15 с субстратом, измеряли в реальном времени с помощью спектрометра LS55 (Perkin-Elmer, Inc.), как описано ранее (4).

Анализы коиммунопреципитации. Клетки 293T выращивали до ~ 80% конфлюэнтности и, используя реагент Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Inc.), их трансфицировали плазмидами для совместной экспрессии pRb _ABC (охватывающих домены ABC pRb) или sNsp15, содержащего a С-концевая метка гемагглютинина (НА) (sNsp15 _HA [любезно предоставлена Ральфом Бариком]) или мутант LC, помеченный аналогичным образом на С-конце (LC _HA).Через 48 ч после трансфекции клетки лизировали в буфере для лизиса клеток (20 мМ Трис [pH 7,5], 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 10% глицерин), и экстракты готовили, как описано ранее (28 ). Экстракты (500 мкг), осветленные центрифугированием при 10000 × g в течение 30 минут при 4 ° C, смешивали с моноклональным антителом против pRb 4h2 (Cell Signaling Technology; каталожный номер 9309) в разведении 1: 100. После 4 ч инкубации при 4 ° C 20 мкл взвеси предварительно уравновешенной агарозы Protein A / G Plus (Santa Cruz Biotechnology, Inc.; каталог нет. sc-2003) добавляли к экстрактам с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° C с покачиванием. Смолу дважды промывали буфером для лизиса клеток и собирали центрифугированием. Затем смолу ресуспендировали в 1 × буфере для образцов для электрофореза для элюирования белков для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Вестерн-блоттинг анализировали с использованием антитела против НА (Abcam, Inc.; каталожный номер ab9134) или моноклонального антитела против убиквитина P4D1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc; каталожный номер sc-8017).

Анализ жизнеспособности клеток и сортировки клеток по флуоресценции (FACS).Клетки Huh7, трансфицированные Nsp15, собирали трипсинизацией. Их промывали дважды PBS, а затем один раз 1 × буфером для связывания аннексина V. Клетки окрашивали аннексином V-флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) в соответствии с рекомендациями поставщика (eBioscience, Inc.; каталог № 88-8005). Мертвые клетки окрашивали 7-AAD (BD Pharmingen; каталожный № 51-68981E) в течение 5 минут при комнатной температуре. Данные были собраны на FACSCalibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и проанализированы с использованием программного обеспечения WinMDI.

Флуоресцентная микроскопия. Клетки Huh7, трансфицированные вектором экспрессии или sNsp15 (sNsp15 _HA, LC _HA или h349A _HA), высевали на предметные стекла с восьмилуночным стеклом. После промывания PBS клетки фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 15 мин. После трех дополнительных промывок PBS клетки прореагировали ледяным 100% метанолом при -20 ° C в течение 10 минут, промыли PBS в течение 5 минут и инкубировали с блокирующим буфером (5% нормальная фетальная бычья сыворотка и 0.5% Triton X-100 в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела против HA и против pRb (4h2) использовали для обнаружения Nsp15 и pRb, соответственно, при разведении 1: 200 с использованием буфера для разведения антител (1% бычий сывороточный альбумин и 0,5% Triton X-100 в PBS). После трех промываний PBS-T (0,5% Tween 20 в PBS) слайды инкубировали с вторичным антителом против козьего IgG, конъюгированным с Texas Red, для обнаружения Nsp15 или вторичным антителом против кроличьего иммуноглобулина, конъюгированным с FITC, для обнаружения pRb в течение 1 часа. при комнатной температуре (при разведении 1: 200).Предметные стекла трижды промывали PBS-T и помещали в монтажную среду Vectashield (Vector Laboratories). Изображения были получены на сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 с масляным объективом HCX PL APO Lambda Blue 63X1.4 (Leica Microsystems). Возбуждение было на частоте 20% Гц, а разрешение изображения составляло 512 × 512 пикселей. Изображения были проанализированы с помощью Leica Application Suite 2.02.

Анализ колониеобразования. Клетки NIH 3T3 высевали в шестилуночные планшеты из расчета 0,25 × 10 ⁶ клеток на лунку и трансфицировали либо одним вектором pUNO, либо sNsp15, экспрессированным из вектора pUNO, с использованием реагента Lipofectamine 2000.Через 24 ч после трансфекции каждую лунку клеток переносили в 10-сантиметровую культуральную чашку и позволяли расти в среде, содержащей 10 мкг бластицидина / мл. Клеткам давали свежую среду, содержащую 10 мкг бластицидина / мл, каждые 3 дня. Через четыре недели колонии фиксировали в метаноле и окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым, приготовленным в 20% этаноле.

Анализ клеточного цикла. Клетки NIH 3T3 трансфицировали в 10-см культуральных чашках либо одним вектором, либо векторами, экспрессирующими sNsp15 дикого типа, с использованием реагента Lipofectamine 2000.Клетки собирали через 36 часов после трансфекции, промывали PBS и ресуспендировали при 2 × 10 ⁶ клеток на мл холодного PBS. Суспензию клеток по каплям добавляли к равному объему холодного абсолютного этанола при непрерывном встряхивании для фиксации клеток. После инкубации в течение ночи при 4 ° C клеточную ДНК окрашивали 500 мкг йодида пропидия (Invitrogen, Inc.) / мл, приготовленного в PBS, содержащем 0,1% (об. / Об.) Triton X-100 (Sigma-Aldrich) и 2 мг. РНКазы А без ДНКазы (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в течение 15 мин в темноте.Образцы фильтровали через нейлоновую сетку для удаления скоплений клеток и анализировали с использованием проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния). Всего было проанализировано 15000 клеток с использованием ModFitLT V3.0.

Анализ люциферазного репортера. Клетки NIH 3T3 высевали в 96-луночные планшеты Costar White из расчета 4 × 10 ⁴ клеток на лунку для трансфекции. При примерно 60-80% конфлюэнтности их котрансфицировали 5 нг репортерной плазмиды phRL-TK (Promega) или phRL-CMV (Promega) вместе с указанными количествами вектора экспрессии для h349A _HA sNsp15 или только вектор экспрессии.Клетки инкубировали в течение 48 часов, чтобы обеспечить экспрессию плазмид. Систему анализа люциферазы Dual-Glo (Promega) использовали для количественной оценки люминесценции с помощью считывателя планшетов FLU-Ostar Optima (BMG Labtech). Индукцию кратности рассчитывали путем нормализации данных с векторным контролем.

Конструирование мутантного MHV. Система обратной генетики MHV-A59 1000 (43) была использована для восстановления вирусов с мутациями в mNsp15. Вкратце, фрагмент BamHI-HpaI размером 3,4 т.п.н., охватывающий интересующую область в mNsp15 из плазмиды F (43), был амплифицирован и клонирован в вектор pGEM-T, как описано ранее (20).Мутацию LC вводили в mNsp15 с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II (Stratagene) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательность фрагмента BamHI-HpaI, несущего мутации в mNsp15, определяли для подтверждения того, что желаемые последовательности были получены. Фрагмент BamHI-HpaI, содержащий мутации, вырезали и повторно лигировали в плазмиду F, расщепленную теми же ферментами. Затем продукты лигирования трансформировали в штамм E. coli Top10. Область восстановленных клонов между сайтами BamHI и HpaI снова секвенировали, чтобы убедиться, что желаемые мутации были восстановлены.Геномы MHV-A59, содержащие mNsp15 WT и мутантные последовательности, были созданы путем лигирования кДНК с последующей транскрипцией in vitro и , и эти геномы затем электропорировали в клетки BHK-R, как описано ранее (43). Культуры наблюдали в течение 72 часов после трансфекции на предмет развития цитопатических эффектов или образования синцития. Затем собирали инфицированные вирусом культуры и замораживали при -70 ° C. Мутантные вирусы подвергали однократной очистке от бляшек и однократно амплифицировали в клетках DBT для получения исходных материалов.Последовательности выделенных вирусов, соответствующие 5′- и 3′-UTR, а также части, кодирующие мутантные белки mNsp15, амплифицировали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией с последующим прямым секвенированием амплифицированных продуктов.

Анализ роста

MHV и образования бляшек. Кривые роста MHV определяли в клетках L2, высеянных в 96-луночные планшеты и выращенных в среде для роста с добавлением 0,1% сыворотки в течение 48 часов. Клетки инфицировали при множественности инфицирования (MOI) 1,0 мутантом mNsp15 (vLC) или WT MHV-A59 в течение 1 часа.Клетки промывали для удаления непривязанного вируса, оставшегося в среде. Культуры скармливали и дополнительно инкубировали до 0, 10, 12, 16, 24, 28 и 30 часов после инфицирования (hpi), после чего их замораживали при -70 ° C. Для всех временных точек были получены образцы в трех экземплярах. Продукцию вируса количественно оценивали с помощью анализов бляшек на монослоях клеток L2.

Сверхэкспрессия

pRb и анализ белка нуклеокапсида (N) MHV. Клетки DBT (2,5 × 10 ⁵ на лунку) высевали на 12-луночные планшеты и трансфицировали либо вектором экспрессии (pUNO), либо вектором, экспрессирующим домены ABC pRb. (pRb _ABC) с использованием реагента Lipofectamine 2000.Через 6 ч после трансфекции клетки промывали и подпитывали свежей средой. Через ~ 36 ч после трансфекции клетки инфицировали либо WT, либо vLC MHV с MOI ~ 5,0. При 4, 6, 8, 10 и 12 hpi среду удаляли, и клетки лизировали 1 × буфером для электрофореза. Равное количество лизата подвергали электрофорезу в 4-12% гелях NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Inc.) и переносили на поливинилидендифторидные мембраны для вестерн-блоттинга. Белок детектировали с помощью моноклональных антител против белка MHV N и вторичных антител против мышей, конъюгированных с пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology), и системы детекции Amersham ECL Plus Western в соответствии с рекомендациями производителя.После обнаружения белка N MHV, блоты обрабатывали трисом (pH 7,0), содержащим 2% SDS и 50 мМ DTT, в течение 2 ч при 37 ° C и зондировали на pRb с использованием моноклонального антитела против pRb 4h2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ортологи Nsp15 коронавируса взаимодействуют с pRb. Поиск мотивов внутри SARS-CoV Nsp15 (sNsp15) выявил мотив LXCXE / D, который характерен для белков, которые связываются с белком ретинобластомы (pRb) (26). Мотив находится в пределах 10 Å от активного сайта эндорибонуклеазы sNsp15 и экспонируется на поверхности белка (рис.1А и Б). Тот же мотив был обнаружен в ортологах Nsp15 альфа- и бета-коронавирусов, и частичный список показан на рис. 1C. Мотив LXCXE / D, однако, не присутствовал во всех ортологах Nsp15 всех коронавирусов. Например, ортологи Nsp15 вируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV; альфа-коронавирус), вируса инфекционного бронхита (IBV, гамма-коронавирус) и коронавируса индейки (TCoV, гамма-коронавирус) лишены этого мотива. Торовирусы, такие как лошадиный торовирус (EToV), и артеривирусы, такие как LDC-V, также лишены узнаваемого мотива LXCXD в Nsp15.Интересно, что мотив LXCXD присутствует в других белках 1ab. Например, мотив обнаружен в белках 1a TGEV 1a и IBV (рис. 1C). Функциональная значимость этих мотивов для других коронавирусов не рассматривается в этой работе.

Рис. 1

pRb-связывающий мотив в белке SARS-CoV Nsp15 и в белках других коронавирусов. (A) Локализация pRb-связывающего мотива (фиолетовый) относительно каталитического сайта эндорибонуклеазы (оранжевый) на гексамере SARS-CoV Nsp15 (sNsp15). Структура SARS-CoV Nsp15 была получена от Bhardwaj et al.(3) (Банк данных по белкам: 2RHB). Белок Nsp15 был из изолята Urbani (номер доступа в GenBank AY278741). (B) Увеличенный вид, показывающий ориентацию и расстояние между остатками pRb-связывающего мотива (фиолетовый) и каталитическим сайтом эндорибонуклеазы (оранжевый) на sNsp15. (C) Выравнивание последовательностей pRb-связывающего мотива в ортологах Nsp15. В следующем списке приведены названия вирусов, проверенных на наличие pRb-связывающего мотива, за которыми следуют номера доступа в GenBank в скобках: SARS-CoV (NC_004718), MHV (NC_001846), BCoV (AF391542), HCoV OC43 (ay391777 ), PheV (YP_459949.1), EcoV (YP_001671996), HCoV HKU1 (ay597011), BatCoV HKU5 (ef065509) HCoV 229E (NC_002645), PeDV (AEQ55003), HCoV NL63 (ABE97136), BATCoV SOC5165 (batCoV), BATCoVHKoV5 (batc) batCoV HKU2 (ABQ57231). Показан номер остатка первого остатка мотива в протеолитически процессируемом ортологе Nsp15 или Nsp15. Некоторые нидовирусы лишены Rb-связывающего мотива в ортологе Nsp15, но содержат такой мотив в других белках, связанных с репликацией. Показаны два примера мотивов в пределах ORF1a TGEV (NC_002306) и IBV (NC_001451).

Мы предполагаем, что pRb будет связывать sNsp15 и влиять на его эндорибонуклеазную активность. Чтобы проверить это, мы получили рекомбинантную усеченную форму человеческого pRb (pRb _AB), которой достаточно для связывания с мотивом LXCXE / D (23) (рис. 2A). Мы также экспрессировали и очищали WT и мутантный sNsp15, названный sLC, который имеет замены аланином L331 и C333 мотива LXCXD (мутантные остатки подчеркнуты) (фиг. 2A). Эксклюзионная хроматография показала, что как sNsp15 дикого типа, так и мутант sLC элюировались преимущественно в виде гексамеров, что необходимо для активности эндорибонуклеазы Nsp15 (16; данные не показаны).Кроме того, мутант sLC предпочтительно расщеплял субстрат тетрануклеотидного флуорофора, содержащий родственный уридилат, и его активность зависела от Mn ²⁺, аналогично WT sNsp15, демонстрируя, что мутация не влияла на активность эндорибонуклеазы (данные не показаны). В присутствии возрастающих концентраций pRb _AB скорость расщепления субстрата sNsp15 дикого типа увеличивалась пропорционально, в то время как расщепление мутантом sLC не оказывалось особого влияния ( n = 3, P <0.0001; Рис. 2Б). WT MHV Nsp15 (mNsp15) также проявлял повышенную активность эндорибонуклеазы в присутствии pRb (фиг. 2B). Эти результаты показывают, что для активности эндорибонуклеазы sNsp15 не требуется pRb, но между белками могут быть взаимодействия.

Рис. 2

Взаимодействие между pRb и Nsp15. (A) SDS-PAGE анализ очищенных белков — человеческий pRb _AB (охватывающие pRb домены AB), sLC (pRb-связывающий мутант SARS-CoV Nsp15) и sNsp15 (SARS CoV Nsp15) — используемых в исследовании .(B) Влияние добавления pRb _AB на эндорибонуклеазную активность (sNsp15), sLC и MHV Nsp15 (mNsp15). (C) Коиммунопреципитация sNsp15 _HA (HA-tagged sNsp15) с коэкспрессией pRb _ABC (домены ABC, охватывающие pRb) из клеточных лизатов. LC _HA (HA-меченный pRb-связывающий мутант sNsp15) и вектор показаны в качестве контролей специфичности. Антитела, используемые для иммунопреципитации (IP) и иммуноблоттинга (IB), показаны слева. Ожидаемое положение миграции Nsp15 на геле (~ 40 кДа) показано справа.(D) Вестерн-блоттинг различных фракций, собранных при прохождении клеточных лизатов, экспрессирующих sNsp15 _HA или LC _HA, через GST-pRb _AB-связанную глутатион-агарозную колонку. Антитела против НА использовали для обнаружения Nsp15 (молекулярная масса ~ 40 кДа).

Чтобы определить, может ли sNsp15 взаимодействовать с pRb в клетках, мы эктопически коэкспрессировали человеческий pRb, охватывающий домены ABC (pRb _ABC), вместе с меченным HA sNsp15 (sNsp15 _HA) или мутантом с заменами аланина L331 и C333 в мотиве LXCXD (мутантные остатки подчеркнуты) (LC _HA) в клетках 293T.Лизаты клеток иммунопреципитировали моноклональным антителом к pRb, а затем подвергали вестерн-блоттингу для обнаружения метки HA в Nsp15. Примечательно, что экспрессия LC _HA в клетках оказалась ниже, чем экспрессия sNsp15 _HA (дополнительные исследования белка LC _HA см. Ниже). Поэтому мы использовали в четыре раза больше лизата, экспрессирующего LC _HA, чтобы довести до сопоставимых количеств WT и LC sNsp15 для иммунопреципитации. Объем для WT sNsp15 _HA регулировали аналогичным образом с помощью клеточного лизата, трансфицированного вектором.Было обнаружено, что WT sNsp15 _HA коиммунопреципитируется с pRb, но не с мутантом LC _HA (фиг. 2C). В независимом анализе очищенный рекомбинантный pRb с меткой GST (pRb-GST) связывали со смолой глутатион-сефароза и инкубировали с клеточными лизатами, экспрессирующими либо sNsp15 _HA, либо LC _HA. После обширных промывок связанные материалы были элюированы и подвергнуты Вестерн-блоттингу. WT sNsp15 _HA, но не мутант LC _HA, был легко обнаружен в связанном материале (рис.2D). Эти результаты показывают, что Nsp15 связывается с pRb в клетках и что мотив LXCXD / E способствует связыванию. Это побудило нас определить последствия взаимодействия pRb-Nsp15.

LC _HA мутант накапливается до более низких уровней, дифференцированно модифицируется и демонстрирует повышенный апоптоз и гибель клеток. Мы постоянно наблюдали, что экстракты из временно трансфицированных клеток содержат меньшее количество белка LC _HA, чем sNsp15 _HA (Рисунок.3А). Кроме того, на денатурирующих полиакриламидных гелях белок LC _HA мигрировал в виде множества полос, как больше, так и меньше, чем молекулярная масса мономера Nsp15, что указывает на ковалентные модификации, а также на деградацию (рис. 2C и 3A). Это контрастирует с sNsp15 _HA, который мигрировал с ожидаемой молекулярной массой мономера (~ 40 кДа) (фиг. 2C и 3A). Чтобы проверить, была ли LC _HA модифицирована убиквитином по сравнению с sNsp15, мы совместно экспрессировали убиквитин в тех же клетках.Клеточные лизаты иммунопреципитировали антителами против НА с последующим вестерн-блоттингом для обнаружения убиквитина. И WT sNsp15 _HA, и LC _HA были положительными по убиквитину (фиг. 3B). Однако, в то время как sNsp15 _HA мигрировал в одной полосе, указывающей на моноубиквитинированную форму, LC _HA существовал в цепочке полос, которая ожидается для полиубиквитинированного белка (фиг. 3B).

Рис. 3

Свойства pRb-связывающего мутанта Nsp15. (A) Вестерн-блоттинг лизатов клеток 293T, трансфицированных вектором sNsp15 _HA или LC _HA.Блоты зондировали антителами против НА. Показано ожидаемое положение миграции Nsp15 на геле (~ 40 кДа). (B) Вестерн-блоттинг, показывающий коиммунопреципитацию убиквитина с sNsp15 _HA и LC _HA из клеточных экстрактов. Клетки, трансфицированные вектором, использовали в качестве контроля. Антитела против НА использовали для иммунопреципитации, а антитела против убиквитина использовали для вестерн-блоттинга. (C) Анализ FACS. Сводная информация о клетках (%), подвергающихся апоптозу и гибели клеток при экспрессии sNsp15 _HA, LC _HA или h349A _HA (мутант по эндорибонуклеазе SARS Co-V sNsp15) представлена в таблице.Клетки трансфицировали для экспрессии sNsp15 _HA, LC _HA или h349A _HA (эндорибонуклеазный мутант sNsp15) и окрашивали для обнаружения аннексина V и ДНК йодидом пропидия (PI). Для анализа данных клетки были разделены на четыре квадранта в зависимости от интенсивности сигнала от аннексина V и PI. В таблице показаны средние процентные доли ячеек в каждом квадранте, и значения были интерпретированы следующим образом. Живые клетки отрицательны как для аннексина V ^— PI ^— (живые), апоптотические клетки положительны для аннексина А, но отрицательны для PI, мертвые клетки отрицательны для аннексина V, но положительны для PI, и клетки, которые и апоптотические, и мертвые, положительны для обоих сигналов.

Мы также исследовали, была ли цитотоксичность причиной более низкого накопления LC _HA. Клетки Huh7 трансфицировали sNsp15 _HA, LC _HA или мутантом эндорибонуклеазы h349A _HA. Через 36 часов после трансфекции клетки окрашивали аннексином V-FITC и 7-AAD для определения апоптоза и гибели клеток соответственно. Анализ FACS показал, что клетки, трансфицированные для экспрессии LC _HA, имели более высокие уровни апоптоза и гибели клеток по сравнению с клетками, трансфицированными sNsp15 _HA — или h349A _HA ( n = 3; P <0.0001; Рис. 3C). Эти результаты показывают, что, когда Nsp15 не может эффективно взаимодействовать с pRb, он дифференцированно модифицируется и обладает цитотоксичностью (фиг. 3B и C).

Эктопическая экспрессия Nsp15 изменяет клеточное распределение pRb. Коронавирусы реплицируются вместе с цитоплазматическими мембранами, хотя некоторые из их белков могут локализоваться в ядре (15). Мы хотели определить клеточную локализацию Nsp15 и pRb. Клетки Huh-7 трансфицировали для экспрессии sNsp15 _HA, LC _HA или h349A _HA.Изображения конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии показали, что sNsp15 _HA локализуется преимущественно в цитоплазме клетки (фиг. 4A). Примечательно, что не все клетки изображения были успешно трансфицированы. pRb был локализован преимущественно в ядрах клеток, которые не экспрессировали sNsp15 _HA. Однако в клетках, экспрессирующих sNsp15 _HA или h349A _HA, pRb был обнаружен как в цитоплазме, так и в ядре (фиг. 4A и B).

Рис. 4

Распределение pRb в клетках, экспрессирующих различные формы sNsp15.(От A до C) Распределение pRb (зеленый) в клетках Huh-7, трансфицированных для экспрессии sNsp15 _HA (красный) (A), h349A _HA (B) и LC _HA (C). Из-за эффективности трансфекции каждое микроскопическое изображение содержит как клетки, экспрессирующие sNsp15, так и те, которые этого не делают. Чтобы облегчить сравнение изображений, репрезентативная клетка, положительная для WT или мутантного sNsp15, идентифицируется символом «+» во всех трех наборах изображений. Типичная клетка, которая не экспрессировала WT или мутантный sNsp15, обозначается символом «ϕ».В присутствии sNsp15 pRb более диффузно диффундирует и колокализуется в цитоплазме с sNsp15. На трех панелях справа показано объединенное изображение окрашивания pRb и Nsp15. На панели C был подготовлен монтаж для увеличения размера образца из-за более низкой экспрессии и / или эффективности трансфекции LC _HA. Белая шкала в правом нижнем углу показывает 25 мм. (D) Вестерн-блоттинг, показывающий уровни pRb (верхняя панель) в ядерной (N) и цитоплазматической (C) фракциях трансфицированных клеток Huh7.На средней панели показана экспрессия Nsp15, оцененная путем зондирования блоттинга антителами против НА. GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) показан в качестве контроля загрузки (нижняя панель).

Чтобы определить, требует ли перераспределение pRb взаимодействия с Nsp15 через мотив LXCXE / D, мы проанализировали локализацию pRb в клетках, трансфицированных LC _HA. В соответствии с результатами вестерн-блоттинга, LC _HA был менее распространенным, и, следовательно, усиление было скорректировано выше, чем для WT sNsp15 _HA или h349A _HA.Мы также идентифицировали клетки с более высокими уровнями белков LC _HA. Даже с этими манипуляциями преимущественное перераспределение pRb в цитоплазму в клетках не было обнаружено в клетках, экспрессирующих LC _HA (фиг. 4C). Кроме того, мы отмечаем, что LC _HA присутствовал на аналогичных уровнях как в ядре, так и в цитоплазме большинства трансфицированных клеток.

Чтобы подтвердить перемещение pRb под действием sNsp15 дикого типа, мы разделили ядерную и цитоплазматическую фракции клеток, трансфицированных для экспрессии sNsp15, и выполнили вестерн-блоттинг для обнаружения pRb.Увеличение содержания pRb наблюдали в цитоплазматической фракции в трех независимых экспериментах, и репрезентативные результаты показаны на фиг. 4D. Эти результаты показывают, что экспрессия sNsp15 коррелирует с перераспределением pRb в клетках.

Nsp15 влияет на функцию pRb. Онкопротеины из ДНК опухолевых вирусов могут связывать pRb и индуцировать клеточно-независимый рост клеток NIH 3T3 в анализе формирования фокуса (9, 11, 21, 23, 29, 41). Мы стремились определить, обладает ли sNsp15 способностью увеличивать формирование фокуса.Фибробласты NIH 3T3 трансфицировали для экспрессии sNsp15 или пустого вектора экспрессии. После 4-5 недель отбора клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым. В четырех независимых экспериментах чашки, содержащие клетки, трансфицированные для экспрессии sNsp15, имели в несколько раз большее количество клеток по сравнению с клетками, трансфицированными пустым вектором (фиг. 5A). Клетки, экспрессирующие sLC, не увеличивали образование колоний, но из-за плейотропных эффектов, связанных с sLC, эти результаты трудно интерпретировать.

Рис. 5

Влияние SARS Co-V Nsp15 на процессы, регулируемые pRb. (А) Анализ образования колоний. На изображениях показан рост клеток NIH 3T3, трансфицированных sNsp15 или вектором. Колонии окрашивали кристаллическим фиолетовым. (B) Распределение клеток в различных фазах клеточного цикла в клетках, трансфицированных вектором или sNsp15, при анализе с помощью FACS. (C) Эффекты экспрессии h349A (мутант эндорибонуклеазы sNsp15) на экспрессию люциферазы с промотора тимидинкиназы (TK) (●) и промотора CMV (○).

Отсутствие контактного ингибирования роста клеток предполагает, что sNsp15, взаимодействующий с pRb, нарушает регуляцию клеточного цикла.Чтобы проверить это непосредственно, клетки NIH 3T3 трансфицировали для экспрессии вектора или sNsp15. Количество ДНК в 15000 клеток на образец было количественно определено с помощью FACS для определения количества клеток в различных фазах клеточного цикла. В трех независимых экспериментах клетки, экспрессирующие sNsp15, стабильно имели ок. На 2–3% больше клеток в S-фазе по сравнению с клетками, трансфицированными пустым вектором ( n = 3, P <0,0001; фиг. 5B). Отметим, что наблюдаемые эффекты, вероятно, будут недооценены из-за эффективности трансфекции <100%.

Наконец, мы исследовали, может ли sNsp15 изменять экспрессию люциферазы Renilla, управляемой промотором тимидинкиназы (TK), который обычно репрессируется pRb (8). В этом анализе взаимодействие между sNsp15 и pRb должно увеличивать активность промотора TK. В этом эксперименте использовали мутант sNsp15 по активному сайту, h349A, поскольку экспрессия sNsp15 дикого типа потенциально может неспецифически снижать экспрессию репортера из-за активности эндорибонуклеазы. Мутант sNsp15 h349A увеличивал уровни люциферазы Renilla зависимым от концентрации образом (рис.5С). Такие же эффекты не наблюдались с люциферазой, экспрессируемой с промотора цитомегаловируса человека (CMV), который не регулируется pRb. В целом, результаты формирования фокуса NIH 3T3, пропорции клеток в S-фазе клеточного цикла и результаты анализа pRb-чувствительный промотор-репортер подтверждают идею о том, что SARS-CoV Nsp15 может изменять регуляцию pRb клеток. рост и экспрессия генов.

Nsp15 подавляет накопление pRb. Некоторые вирусные белки, которые взаимодействуют с pRb, могут ускорять его деградацию (5, 21, 27).Чтобы определить, имеет ли это место также с sNsp15, уровень pRB _ABC исследовали в временно трансфицированных клетках 293T с помощью вестерн-блоттинга. В шести независимых анализах клетки, экспрессирующие sNsp15 дикого типа, имели в 3-4 раза меньшее количество pRb по сравнению с векторным контролем (фиг. 6A). Недостаточный по эндорибонуклеазе мутант h349A также снижал уровни pRb, хотя и не в такой степени, как sNsp15 дикого типа (фиг. 6A), что указывает на то, что снижение уровня pRb с помощью Nsp15 может быть комбинированным эффектом его активности эндорибонуклеазы и усиленной деградации белка.

Рис. 6

Уровни pRb в клетках. (A) Вестерн-блоттинг, показывающий уровни экспрессии pRb _ABC в клетках, коэкспрессирующих либо вектор, sNsp15 _HA, либо h349A _HA. (B) Влияние ингибитора протеасом MG132 на уровни pRb _ABC в присутствии sNsp15 _HA. (C) Вестерн-блоттинг, показывающий количество убиквитинированного pRb в клетках, трансфицированных вектором (V) или sNsp15 _HA. Моноклональные антитела против pRb использовали для иммунопреципитации (IP), а антитела против убиквитина использовали для вестерн-блоттинга (IB). Ожидаемое положение pRb _ABC указано звездочкой.Блот очищали и повторно зондировали антителами против pRb (нижняя панель).

Обилие

pRb, как было показано, регулируется несколькими путями, включая убиквитин-зависимый протеолиз протеасомой (39). Чтобы определить, связано ли снижение уровней pRb с усилением протеолиза в присутствии sNsp15, мы обработали клетки, трансфицированные sNsp15 _HA, ингибитором протеасом MG132 и наблюдали, что уровни pRb увеличились до 4 раз без влияния на уровни sNsp15 ( Инжир.6Б). Этот результат предполагает, что эффект sNsp15 на накопление pRb затрагивает протеасомы.

Затем мы проверили, коррелирует ли снижение уровней pRb с увеличением убиквитинирования. Антитело, специфичное к pRb, использовали для иммунопреципитации клеточных лизатов, а осажденный материал подвергали вестерн-блоттингу с моноклональным антителом к убиквитину (фиг. 6C). В дополнение к IgG, используемому в анализе иммунопреципитации, мазок с повышенной плотностью, как было обнаружено, исходил из полосы массы, соответствующей немодифицированному pRb, что согласуется с повышенным убиквитинированием pRb в присутствии sNsp15.

Взаимодействие между pRb и Nsp15 необходимо для оптимальной инфекции MHV. Чтобы проверить, является ли взаимодействие между Nsp15 и pRb значимым для вирусной инфекции в культуре клеток, мы использовали MHV (штамм A59) в качестве суррогатного коронавируса. MHV является подходящей заменой SARS-CoV, поскольку его белок Nsp15 (mNsp15) имеет структуру, почти идентичную структуре Nsp15 SARS-CoV и идентичный механизм расщепления (42). Кроме того, он имеет последовательность, связывающую pRb, и эндорибонуклеазная активность рекомбинантного mNsp15 также увеличивалась в присутствии pRb (рис.1А и 2Б).

Чтобы нарушить взаимодействие между Nsp15 и pRb, мы сконструировали мутантный MHV, названный vLC, где два остатка предполагаемой последовательности связывания pRb (LWCNE) были мутированы в аланины (AWANE; мутированные остатки подчеркнуты) с использованием обратной генетической системы, описанной Yount и другие. (43). Мутантная vLC образовывала бляшки на монослоях клеточной линии L2, диаметр которых постоянно уменьшался до прибл. 60% из них сформированы WT MHV (рис. 7A и B). Максимальный титр вируса, полученный с помощью vLC, был снижен от 5 до 1 log по сравнению с WT MHV в трех экспериментах (рис.7C). Эти результаты предполагают, что потеря взаимодействия между pRb и mNsp15 пагубно сказывается на оптимальной инфекции MHV.

Рис. 7

Морфология бляшек и кривая роста мутантного VLC MHV. (A) Типичная морфология бляшек WT и мутантного vLC MHV A59. (B) Диаметр бляшек, созданных четырьмя независимыми мутантами vLC по сравнению с WT MHV A59. (C) PFU, генерируемая WT или vLC MHV, как функция времени.

pRb перераспределяется и подавляется во время инфекции MHV. Мы хотели изучить, повлияет ли инфекция MHV на накопление и клеточное распределение pRb.Клетки L2 инфицировали либо WT, либо vLC MHV при MOI ~ 1,0 в течение 4 часов и исследовали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивали для обнаружения pRb, а также белка N MHV. pRb был локализован преимущественно в ядре неинфицированных клеток (рис. 8А, верхние панели). Однако в клетках, инфицированных MHV WT, значительное количество pRb также присутствовало в цитоплазме (фиг. 8A, средние панели). Подобное цитоплазматическое распределение pRb не наблюдалось в клетках, инфицированных vLC (рис.8А, нижние панели). Кроме того, большинство vLC-инфицированных клеток оказались больше по размеру, чем WT-инфицированные MHV клетки, и N-белок присутствовал как в ядре, так и в цитоплазме, в отличие от WT-инфицированных MHV клеток, где он был преимущественно цитоплазматическим, открытие согласуется с нашим предыдущим наблюдением, что LC-мутант sNsp15 оказывает плейотропное действие на физиологию клеток.

Рис. 8

Распределение и уровни pRb во время инфекции MHV. (A) Изображения конфокальной микроскопии клеток L2, показывающие распределение pRb (красный) и белка N MHV (зеленый) в необработанных клетках (верхние панели), WT-инфицированных MHV клетках (средние панели) и vLC-инфицированных MHV клетках (нижние панели).Правые панели показывают объединенное изображение окрашивания белков pRb и N. pRb окрашивают кроличьими антимышиными антителами и конъюгированными против кроличьими вторичными антителами Texas Red. Белок N окрашивают моноклональными антителами против белка MHV N и вторичными антителами против мышиных антител, конъюгированными с Alexa Fluor 488. Белая шкала на правой панели показывает 25 мкм. (B) Вестерн-блоты, показывающие уровни pRb в лизатах цельных клеток (верхняя панель). Уровень GAPDH использовался в качестве контроля загрузки (нижняя панель). (C) Вестерн-блоты, показывающие уровни pRb в цитоплазматической фракции (верхняя и средняя панели).GAPDH (нижняя панель) служит для контроля загрузки. Клетки L2 инфицировали либо WT, либо vLC MHV. Клетки собирали 1 или 5 hpi. Незараженные клетки (UI) использовали в качестве контроля. Вестерн-блоттинг зондировали антителами против pRb на панелях B и C.

Для исследования накопления pRb во время инфекции MHV клетки L2 инфицировали WT или vLC MHV или ложно инфицировали. Количество pRb в лизатах цельных клеток и цитоплазматических фракциях определяли с помощью вестерн-блоттинга. Анализ лизатов цельных клеток показывает, что количество pRb было немного ниже в клетках, инфицированных MHV и vLC дикого типа, по сравнению с неинфицированными клетками (рис.8B), тогда как уровень pRb был в ~ 2 раза выше в цитоплазматических фракциях MHV-инфицированных WT клеток по сравнению с неинфицированными или vLC-инфицированными клетками 1 hpi (фиг. 8C). Эти данные демонстрируют, что инфекция MHV может увеличивать накопление pRb в цитоплазме (рис. 8). Кроме того, перераспределение pRb наблюдалось уже через 1 ч после инфицирования MHV. Наблюдалось ~ 2-кратное снижение накопления pRb и появления продукта разложения при WT MHV при 5 hpi. Напротив, уровни цитоплазматического pRb в клетках, инфицированных vLC, по-видимому, не изменились даже на 5 hpi (рис.8C). Снижение уровней pRb при инфицировании WT MHV по данным вестерн-блоттинга было больше, чем наблюдаемое на микроскопических изображениях, где pRb, по-видимому, намного ярче при заражении MHV WT (фиг. 8A). Потенциальным объяснением этого может быть обнаружение как частично деградированного, так и полноразмерного pRb в экспериментах по микроскопии, в то время как результаты вестерн-блоттинга относятся к полноразмерному pRb. Эти результаты показывают, что инфекция MHV сопровождается перераспределением и подавлением pRb, вероятно, из-за его взаимодействия с Nsp15.

Влияние клеточных уровней pRb на инфекцию MHV. Мы полагаем, что если pRb подавляется во время инфекции MHV, сверхэкспрессия pRb должна отрицательно влиять на инфекцию MHV. Более того, сверхэкспрессия pRb должна иметь меньшее влияние на мутант vLC. Чтобы изучить эту возможность, мы эктопически экспрессировали pRb _ABC в клетках DBT до инфицирования WT или vLC MHV. Клетки, трансфицированные вектором, использовали в качестве контроля. В указанные сроки после заражения клетки собирали для анализа уровня белка N MHV с помощью вестерн-блоттинга.Клетки со сверхэкспрессией pRb _ABC демонстрировали отсроченное появление белка N на срок до 2 часов по сравнению с клетками, трансфицированными пустым вектором (фиг. 9). Кроме того, сверхэкспрессия pRb, по-видимому, не влияла на появление белка N в клетках, инфицированных vLC. Идентичные результаты наблюдались в двух независимых экспериментах. Мы отмечаем, что уровни pRb _ABC были снижены как WT, так и vLC MHV после 8 hpi (рис. 9, нижние панели).

Рис. 9

Влияние сверхэкспрессии pRb на инфекцию MHV.Вестерн-блот показывает уровень вирусного нуклеокапсида (N) и белка pRb _ABC, экспрессированного в клетках DBT, трансфицированных вектором (+ V) или pRb _ABC (+ pRb _ABC) и впоследствии инфицированных одним из WT (слева). панели) или vLC MHV (правые панели). Время сбора образцов показано над изображением вестерн-блоттинга. Белок N MHV детектировали с помощью моноклональных антител против белка MHV N и вторичных антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. pRb детектировали с помощью моноклональных антител против pRb человека и вторичных антител против мышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы обнаружили, что Nsp15 может взаимодействовать с pRb, увеличивать экспрессию генов, которые обычно репрессируются pRb, и увеличивать долю клеток в S-фазе клеточного цикла. Титр вируса, продуцируемый MHV с мутацией в Nsp15, влияющей на взаимодействие с pRb, снижался до 1 log. Кроме того, сверхэкспрессия pRb в клетках задерживает время экспрессии N-белка. Эти результаты подтверждают идею о том, что коронавирусы могут влиять на экспрессию генов, связанных с клеточным циклом, посредством новой функции предполагаемой эндорибонуклеазы, Nsp15, которая, вероятно, изменяет метаболический статус клеток-хозяев в свою пользу.

Влияние метаболического статуса хозяина на репликацию вируса было подчеркнуто наблюдением, что трансформированные клетки являются лучшими хозяевами для коронавируса мышиного гепатита (40). Кроме того, важность коронавируса, влияющего на регуляцию клеточных генов через прогресс клеточного цикла, подчеркивается белком Nsp1 MHV, который, как сообщается, ингибирует продвижение в клеточный цикл при переходе G ₀ / G ₁ за счет уменьшения Cdk1. уровни и накопление гипофосфорилированного pRb (6).Поскольку мотив LXCXD / E связывается преимущественно с гипофосфорилированным pRb (23), можно предположить, что Nsp1 накапливает гипофосфорилированную форму pRb для взаимодействия с Nsp15.

Наши наблюдения за повышенной перемещением pRb в цитоплазму и ассоциацией с убиквитином показывают, что следствием взаимодействия с Nsp15 является деградация pRb, вероятно, посредством пути убиквитин / протеасома. Белки-супрессоры опухолей p53 и p27 ^Kip1 также перераспределяются в цитоплазму для их деградации (14, 19).Мы с интересом отмечаем, что Nsp15, лишенный сайта связывания pRb (sLC) дикого типа, накапливается до более низких уровней и обладает значительной цитотоксичностью, предполагая, что взаимодействие с pRb стабилизирует Nsp15 и имеет другие последствия для вирусной инфекции. Пока не ясно, почему Nsp15, по-видимому, требует pRb для своей собственной стабильности и усиливает подавление pRb. Однако наблюдаемые эффекты на процессы, регулируемые pRb, и экспрессию генов, вероятно, связаны с прямым взаимодействием белков, поскольку pRb может коиммунопреципитировать с Nsp15 и увеличивать активность эндорибонуклеазы.Кроме того, мы с интересом отмечаем, что Nsp15, лишенный сайта связывания pRb дикого типа, обладал значительной цитотоксичностью, предполагая, что взаимодействие с pRb имеет другие последствия для вирусной инфекции.

Особенно важным для инфекции MHV является то, что эффект на pRb наблюдался через 1 час после заражения, что позволяет предположить, что ослабление pRb является ранним событием инфекции (рис. 8 и 9). Мы также наблюдали резкое снижение уровней pRb _ABC через 8 hpi (фиг. 9) во время инфицирования как WT, так и vLC MHV.Этот эффект, вероятно, происходит из-за остановки трансляции хозяина, вызванной MHV. Хотя мутация, предотвращающая взаимодействие Nsp15 и pRb, снижает продукцию вирионов MHV только на 1 log за один цикл инфекции, она, вероятно, будет иметь гораздо более драматический эффект в организме-хозяине во время нескольких раундов инфекции. Кроме того, pRb взаимодействует с несколькими клеточными белками и регулирует экспрессию множества генов, в том числе генов, связанных с клеточным циклом (32), и генов иммунного ответа, в том числе генов, связанных с интерлейкином-6 (IL-6) и IL-8 (7 , 44).ДНК опухолевых вирусов и ВГС связаны с раком, а взаимодействие с pRb обеспечивает один механизм для изменения регуляции развития клеточного цикла. Не известно, что коронавирусы связаны с раком, но нарушение регуляции клеточного цикла будет влиять на метаболизм клетки и накопление генных продуктов, что способствует оптимальной вирусной инфекции.

Мы наблюдали, что многие, но не все члены альфа- и бета-коронавирусов содержат Rb-связывающий мотив на своей эндорибонуклеазе (рис. 1А).Интересно, что представители рода гамма-коронавирусов и родственных нидовирусов не имеют последовательности LXCXE / D в своих ортологах Nsp15. Однако такие мотивы можно найти в другом белке в открытой рамке считывания 1ab. Это предполагает, что взаимодействие с Rb может быть важным, хотя для активности эндорибонуклеазы этого взаимодействия не требуется. Функциональная значимость наблюдаемых мотивов у других нидовирусов должна быть исследована непосредственно перед тем, как делать какие-либо выводы о конкретных требованиях взаимодействия Rb в процессе инфицирования.

Amazon.com: Гоночная платформа нового уровня v3 (NLR-M001V3): видеоигры

ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ МИРОВОГО УРОВНЯ

Платформа Next Level Racing Motion разработана и спроектирована специально для движения сиденья, чтобы обеспечить наиболее реалистичное погружение в погружение разумом и телом.Благодаря этой конструкции и технологиям он был протестирован и доказан, что он более эффективно чувствует перегрузки за счет мышечного давления, которое вы бы не почувствовали, если бы колесо и педали двигались одновременно. Это давление, приложенное к вашему телу и мышцам, может более реалистично воспроизводить и выдерживать те же перегрузки, что и реальный автомобиль. Этот метод перемещения только сиденья используется не только профессиональными автогонщиками для тренировок, но и на некоторых из самых современных и высокотехнологичных симуляторов движения, включая CXC Simulations.Платформа также имеет тактильную обратную связь благодаря возможности двух боковых / точечных вибраций с использованием истинной игровой обратной связи на основе информации автомобильной телеметрии для имитации неровностей дороги, текстуры дороги, вибрации, переключения передач, столкновений, горизонтальных трений и неровностей.

ПРОИЗВОДСТВО МИРОВОГО КЛАССА

Motion Platform V3 — это продукт, произведенный с высочайшим качеством и комплектующими в Европе, что обеспечивает надежность и производительность.Платформа — это продукт, созданный на основе многолетнего опыта в области моделирования в сочетании с ведущими европейскими инженерами по движению и программному обеспечению в MotionSystems. Платформы Next Level Racing Motion используются не только гонщиками-симуляторами со всего мира, но также ведущими университетами, силами военной обороны, учебными заведениями и профессиональными водителями / пилотами.

ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ, ЛИДИРУЮЩЕЕ НА РЫНКЕ

Платформа поставляется в комплекте с программным обеспечением Next Level Racing Platform Manager.Это профессиональное и специализированное программное обеспечение для платформы, оно совместимо со всеми основными гоночными и летными играми на ПК и постоянно обновляется для поддержки новых игр по мере их выпуска. Platform Manager — мощный движок, но он прост в использовании, что означает, что вы можете регулировать уровни движения, неровностей, крена и тангажа одним нажатием кнопки. Программное обеспечение также включает в себя прогресс VR, который использует сложные математические формулы для расчета необходимой компенсации и применяет их к гарнитуре VR во время выполнения, что означает наиболее достоверное и захватывающее моделирование.Платформа Next Level Racing Motion разработана для простоты использования с минимальной технической поддержкой, необходимой для сборки и эксплуатации, что означает, что вы можете легко установить платформу самостоятельно и начать гонку / летать с полным движением менее чем за час.

VR И КОММЕРЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Платформа Next Level Racing Motion в сочетании с VR — это просто невероятный опыт, некоторые из наших любимых игр включают Project Cars, Assetto Corsa, Dirt Rally и iRacing.Для компаний VR, разработка собственного программного обеспечения SDK доступна за дополнительную плату. Наш SDK позволяет интегрировать стороннее программное обеспечение и добавлять движение для индивидуальных проектов VR. Платформа Next Level Racing Motion — прочный продукт, который также подходит для коммерческого использования.

Математика | Бесплатный полнотекстовый | Вычислительная модель механо-электрической стимуляции кардиомиоцитов для усиления регенерации сердечной ткани

Для изучения клеточного ответа на ЭС, а также на механический стимул, была разработана трехмерная вычислительная модель.Настоящая модель включает клеточные процессы, такие как миграция, созревание и пролиферация, а также взаимодействие и адгезия клеток. Модель разработана на основе метода конечных элементов (МКЭ) и зависит от внутренних деформаций ячейки.

2.1. Миграция клеток

Миграция клеток, описанная в этом разделе, основана на сократительном эффекте актин-миозинового (AM) аппарата [31,32,33]. Во время миграции клеток клетка, которая прикреплена к ECM посредством фокальных адгезий, сокращается под действием сборки AM.Это сжатие имеет два эффекта: для оценки механической среды клетки (жесткости) и для создания импульса клетке. После оценки условий ECM, передняя часть клетки (преимущественное направление миграции) генерирует новые адгезии, тогда как задняя часть высвобождает их [34,35]. Этот эффект вместе с клеточным сокращением перемещает клетку в новое место. Направление, в котором мигрирует клетка, определяется набором событий, которые включают случайную [36] или управляемую [37,38] полимеризацию актина [34,39].Таким образом, связь между внутренними напряжениями ячейки, создаваемыми сжатием AM, и производимой деформацией в ECM (рис. 1) была установлена следующим уравнением [40,41]:

σi = Kpasεiεi <εminorεi> εmax, Kactσmax (εmin − εi) Kactεmin − σmax + Kpasεiεmin≤εi≤ε˜, Kactσmax (εmax − εi) Kactεmax − σmax + Kpasεiε˜≤εi≤εmax, 9000

(1)

где σi — внутренние напряжения, создаваемые клеточной деформацией εi в каждой оцениваемой точке FE клеточной мембраны. Kpas и Kact, соответствуют жесткости пассивного и активного элементов ячейки соответственно.σmax, εmax и εmin соответствуют максимальному напряжению, создаваемому сжатием двигателя AM, максимальной и минимальной деформации, соответственно, для которых AM создает активные напряжения. Наконец, ε˜, является клеточной деформацией, для которой создается максимальное усилие, и определяется как ε˜ = σmax / Kact. Во время процесса миграции внутренние напряжения передаются на ECM через множественные очаговые адгезии в виде тяговых сил, Ftraci . Величина этих сил зависит, помимо внутренних напряжений σi, от концентрации лигандов ψ и количества доступных рецепторов nr на клеточной мембране как [27,30]: где S — поверхность мембраны, k — константа связывания, а ei — единичный вектор, который указывает от оцененной точки мембраны к центроиду клетки.Тогда результирующая сила тяги, Ftrac, получается через вклад n сил ячейки как [42,43]:

В дополнение к силам тяги, модель учитывает влияние сил, создаваемых электрическим полем, Felec, силы, возникающие из-за образования выступов, Fprot, и силы сопротивления, Fdrag, из-за вязкости ECM.

Различные исследования наблюдали линейную зависимость поведения мигрирующих клеток от электрического поля [17,20,44]. Например, Б.Frederich et al. исследовали различные клетки сердца в постоянном электрическом поле различной интенсивности, сделав вывод, что эффект ЭС пропорционален величине электрического поля [18]. Кроме того, C. Chen et al. показали в своем обзоре, что ES стимулирует миграцию клеток, а среднее смещение увеличивается по мере увеличения интенсивности ES, что является полезным инструментом для регулирования поведения клеток [44]. Эта производительность объясняется влиянием Ca2 +, который вызывает гиперполяризацию клетки в направлении электрического поля (рис. 2).Следовательно, сила FEF, с которой ячейка увлекается электрическим полем, E, может быть определена как: где Ω — поверхностная плотность заряда клетки, S — поверхность клеточной мембраны, а eEF — направление электрического поля. Плотность поверхностного заряда может быть получена с помощью уравнений заряда мембраны Гуи-Чепмена как функции потенциала покоя мембраны [45]. Различные эксперименты показывают, что, хотя существует линейная зависимость между напряженностью электрического поля и скоростью миграции клеток, клетки также обнаруживают порог, при котором эта скорость больше не увеличивается.Это значение EF, при котором возникает насыщение электрических сил, Esat, по-видимому, зависит от анализируемого типа клеток [18,19,21,44]. Этот эффект насыщения был определен при расчете плотности электрического заряда ячейки как:

Ω = Ω (z, ψ) E≤Esat, ΩsatE> Esat,

(5)

где Ωsat — заряд насыщения поверхности ячейки, а Esat — электрическое поле, для которого силы электрического элемента показывают насыщение. Настоящая модель также учитывает локальную силу отталкивания, создаваемую отдельным зарядом ячеек.Электрическая сила отталкивания FEFij, испытываемая ячейками i и j, пропорциональна электрическому заряду ячеек, Ωi и Ωj, и обратно пропорциональна расстоянию между ними, rij. Его можно рассчитать по [27,28]:

FEFij = keϵrΩiSiΩjSjrij2eij,

(6)

где ke — кулоновская постоянная, ϵr — относительная диэлектрическая проницаемость ЭЦМ, а eij — направление от j-й ячейки к i-й ячейке. С учетом сил, генерируемых каждой j-й соседней ячейкой, и сил, обусловленных электрическим полем, общая сила, действующая на i-ю ячейку, Felec, может быть получена следующим образом:

Felec = FEF + ∑j = 1n − 1FEFij.

(7)

Силы протрузии из-за расширения и втягивания выступов ячейки создают расширения ячейки, которые увеличивают проникновение ячейки. В целом это считается случайным процессом. Таким образом, величина и направление сил выступа, Fprot, были рассчитаны как [40,43]:

Fprot = κ‖Ftrac‖ernd,

(8)

где κ — случайное значение между 0≤κ <1, а ernd - случайный единичный вектор. Наконец, эффект силы сопротивления, Fdrag, рассматривался как сила, которая противодействует движению ячейки из-за вязкости среды, η .Он был определен законом Строкса как сила сопротивления ячейке радиуса r, которая движется со скоростью v, как: Предлагая баланс сил на ячейку и пренебрегая инерционными эффектами из-за масштаба проблемы, мы получать:

Ftrac + Felec + Fprot = Fdrag,

(10)

посредством которого определяются направление и скорость миграции клеток.

2.2. Взаимодействие клеток

Клетки демонстрируют коллективный ответ, отличный от их индивидуального поведения. Межклеточное взаимодействие оказывает большое влияние на такие процессы, как пролиферация клеток [46,47] и миграция [48,49].Посредством межклеточных взаимодействий клетки устанавливают межклеточные связи путем связывания, например, своего цитоскелета через десмосомы или электронной связи через щелевые соединения [50,51,52]. В противоположность этому клетки теряют часть способности взаимодействовать с ECM вдоль контактной поверхности между двумя клетками. В мышечных клетках особенно важно межклеточное взаимодействие, где конечная функциональность ткани сильно зависит от качества соединения между клетками [24,50].Таким образом, для развития мышечных тканей in vitro необходимо правильное наведение клеток на соответствующую архитектуру. Таким образом, вектор контакта с ячейкой определяется для любой пары ячеек через векторы положения этих ячеек (рис. 3a), как [41,43]: где Xi и Xj — векторы позиций i-й и j-й ячеек соответственно. Чтобы избежать перекрытия ячеек, Xij должен удовлетворять Xij≥2r. Направление контакта ячеек можно определить как: в то время как направление поляризации клетки может быть определено механическими, emechi и электрическими, eeleci, стимулами, которым подвергается клетка, а именно:

epoli = emechi + eeleci‖emechi + eeleci‖,

(13)

где emechi и eeleci — направление механических и электрических раздражителей, соответственно, рассчитываемое как:

emechi = Ftrac‖Ftrac‖,

(14)

а также

eeleci = Felec‖Felec‖.

(15)

Кардиальные ткани состоят из высокоупорядоченных миофибрилл, размер, количество и сложность которых увеличивается по мере развития ткани [3,23,53]. Таким образом, клетки, управляемые различными стимулами в ECM, поляризуются и присоединяются к другим клеткам, образуя структуры, подобные мышечным трубочкам. Например, В. Планат-Бенар и др. изучили дифференцировку кардиомиоцитов, наблюдая, как клетки сердца дифференцируются и образуют структуры миотубул после 14 дней культивирования клеток [54]. Кроме того, как показали Н. Тахара и др.миграция кардиальных предшественников показала, что CM становятся связанными, чтобы сформировать когерентный эпителий в популяциях двусторонних сердечных предшественников [55]. Такое поведение можно наблюдать в различных исследованиях in vitro [3,15,56,57]. В этом контексте мы определяем глобальное направление поляризации, Gpol, это индикатор степени выравнивания ячеек, который указывает основное направление, в котором ячейки структурированы (рис. 3b). Это направление получается путем оценки направления поляризации всех ячеек как:

Гпол = Rpol‖Rpol‖,

(16)

где

Rpol = ∑i = 1nepoli‖epoli‖.

(17)

Это направление сравнивается с направлением контакта клетка-клетка, чтобы определить качество клеточной адгезии. Таким образом, чтобы сравнить направление контакта клеток, eij, с направлением глобальной поляризации, Gpol, параметр проекции lij был определен как:

lij = Proj (eij, Gpol) ‖Gpol‖,

(18)

где его значение ограничено диапазоном 0 Fdraggrp = ∑i = 1nFtraci + Feleci + Fproti,

(19)

где Ftraci, Feleci, Fproti соответствуют вкладу механической, электрической и выталкивающей сил, соответственно, каждой i-й ячейки в группу.Fdraggrp соответствует силе сопротивления группы, которую можно рассчитать по [43]:

Fdraggrp = fsh6πrgrpηvgrp,

(20)

где rgrp и vgrp — эквивалентный радиус и скорость группы соответственно. fsh — коэффициент формы из-за неправильной формы группы, рассчитываемый как [30,43,60]:

fsh = lmaxlmedlmin20.09,

(21)

где lmax, lmed и lmin соответствуют максимальному, среднему и минимальному размерам группы, соответственно, которые определены в ортогональной системе координат.Кроме того, ячейки могут быть перемещены на новые, более выгодные позиции в пределах той же группы. После оценки перемещения группы, если группа не перемещается, оценивается индивидуальная миграция клеток этой группы, vi. В этом случае, если ячейка имеет возможность перемещаться в новую и доступную позицию в группе, то она перемещается в эту новую позицию (рис. 4c). Таким образом, клетки, принадлежащие к группе, могут мигрировать вместе с группой или перемещаться внутри нее [22,43,61].

2.3. Cell Fate

Механические свойства ЕСМ не только влияют на миграцию клеток, но также важны для таких процессов, как созревание, пролиферация и апоптоз. В случае сердечных клеток механоэлектрические условия, которым они подвергаются во время созревания, являются ключевыми для развития функциональных тканей [11]. Например, при разных механических стимулах клетки созревают с разной скоростью, показывая более быстрое созревание в более жестких ECM [62,63,64]. Чтобы учесть влияние механического стимула γc (t), которому клетка подвергается в каждый момент времени t, на основе ее внутренней деформации, εi, механический стимул можно определить как (см. Рисунок 3c) [28 , 65]:

γc (t) = 1n∑i = 1nei: εi: eiT,

(22)

где εi и ei — внутренняя деформация ячейки и вектор положения, соответственно, i-го узла ячейки, а n — количество узлов, в которых ячейка была дискретизирована.Время созревания клетки tmat (γc, t), которое представляет собой время, необходимое клетке для достижения необходимого уровня зрелости для пролиферации, получается для каждой клетки на каждом временном шаге с учетом механического стимула γc (t), в виде:

tmat (γc, t) = tmin + tpγc (t),

(23)

где tmin — минимальное время, необходимое для созревания. tp — коэффициент пропорциональности времени, который зависит от механического стимула. Чтобы определить статус созревания каждой клетки, мы определили индекс созревания (MI) как:

MI = ttmatt≤tmat, 1t> tmat.

(24)

Когда достигается зрелость, MI = 1, клетка имеет возможность пролиферировать. Однако способность сердечных клеток к пролиферации ограничена [66,67] и тесно связана с остановкой клеточного цикла и межклеточными соединениями [23,68]. В этой модели рассматривается адаптивный клеточный фенотип. Таким образом, сердечные клетки, первоначально рассматриваемые как CM на ранних стадиях созревания (ранние CM), и по достижении состояния зрелости, MI = 1, могут продвигаться в зрелости своего сердечного фенотипа и достигать состояния взрослого CM. (поздний СМ).Это изменение фенотипа связано со способностью клеток образовывать стабильные межклеточные адгезии [23,54,68]. Фактически, взрослые CM сильно упорядочены в стабильных миофибриллах, что предотвращает деление клеток [23]. Таким образом, пролиферация CM тесно связана с созреванием клеток и межклеточными адгезиями [23]. Таким образом, ранний CM сохраняет способность к пролиферации, тогда как взрослый CM считается постмитотическим и не пролиферирует [23,67,69]. Таким образом, пролиферация клеток была определена как функция количества CJ, что определяет образование стабильных клеточно-клеточных адгезий и ИМ, который определяет статус клеточного цикла.В то время как клетка, полностью включенная в цепь, подвергается остановке клеточного цикла, что блокирует пролиферацию клеток. Напротив, свободные клетки или частично прикрепленные к цепи сохраняют свою способность к пролиферации из-за того, что они рассматриваются как ранний фенотип CM. Этот процесс определяется следующим уравнением:

Клеточная пролиферация = 1 мать → 2 дочери CJi

(25)

где CJi — количество клеточных соединений в i-й клетке, а CJmax — количество клеточных соединений, которое способствует остановке клеточного цикла [70].Таким образом, если клетка частично окружена, означает, что она прикреплена по крайней мере к 4 другим клеткам (CJmax = 4), что соответствует 50% максимально возможного CJ из-за дискретности модели, фенотип сердечной клетки считается для достижения фенотипа взрослого человека. и пролиферация клеток подавляется [43]. Как только клетка пролиферирует, она генерирует две дочерние клетки. Расположение этих новых ячеек было определено как:

xdaut (1) = xmoth, xdaut (2) = xmoth + 2rerand,

(26)

где xmoth, xdaut (1) и xdaut (2) — векторы координат материнской ячейки, первой и второй дочерних клеток, соответственно.erand — это случайно сгенерированный единичный вектор.

PSMA3 — Субъединица протеасомы альфа-типа 3 — Homo sapiens (Human)

Обозначение объекта	Позиция (я)	Описание Действия	Графическое изображение	Длина
В этом подразделе раздела PTM / Processing указано, что метионин инициатора отщепляется от зрелого белка. . Подробнее … Инициатор метионин ⁱ		Удалено Подтвержденная вручную информация, полученная на основе экспериментальных и расчетных данных. Дополнительно … Утверждение, сделанное вручную, выведено из комбинации экспериментальных и расчетных данных ⁱ Процитировано для: АЦЕТИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] В SER-2, ОТСИЛЕНИЕ ИНИЦИАТОРНОГО МЕТИОНИНА [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ МАССИФИКАЦИИ], ИДЕНТИФИКАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ АНАЛИЗ]. Процитировано для: АЦЕТИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] В SER-2, ОТРЫВ МЕТИОНИНА ИНИЦИАТОРА [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ], ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. «Анализ N-концевого ацетилома и функциональное понимание N-концевой ацетилтрансферазы NatB». Ван Дамм П., Ласа М., Полевода Б., Газкес К., Элосеги-Артола А., Ким Д.С., Де Хуан-Пардо Э., Демейер К., Хоул К., Ларреа Э., Тиммерман Э. , Прието Дж., Arnesen T., Sherman F., Gevaert K., Aldabe R. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 109: 12449-12454 (2012) [PubMed] [Europe PMC] [Резюме] Цитируется для: АЦЕТИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] В SER-2, ОТЛОЖЕНИЕ ИНИЦИАТОРА МЕТИОНИНА [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ], ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАССЫ [МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Ручное утверждение на основе эксперимента в ⁱ
В этом подразделе раздела «PTM / Обработка» описывается протяженность полипептидной цепи в зрелом белке после процессинга или протеолитического расщепления. Подробнее … Цепочка ⁱ PRO_0000124091	2–255	Субъединица протеасомы альфа-типа-3 Добавить BLAST		254
Функциональный ключ	Позиция (я)	Описание Действия	Графическое представление	Длина
В этом подразделе раздела «PTM / Обработка» указываются положение и тип каждого измененного остатка, за исключением lipids , гликаны и перекрестные ссылки протеина . Подробнее … Модифицированный остаток ⁱ	2	N-ацетилсерин Утверждение, сделанное вручную на основе комбинации экспериментальных и расчетных данных ⁱ Цитируется для: АЦЕТИЛИРОВАНИЕ [АНАЛИЗ В БОЛЬШОМ МАСШТАБЕ, СЕРИЯ-2] ИНИЦИАТОР МЕТИОНИН [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ], ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Процитировано для: АЦЕТИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] В SER-2, ОТРЫВ МЕТИОНИНА ИНИЦИАТОРА [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ], ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. «Анализ N-концевого ацетилома и функциональное понимание N-концевой ацетилтрансферазы NatB». Ван Дамм П., Ласа М., Полевода Б., Газкес К., Элосеги-Артола А., Ким Д.С., Де Хуан-Пардо Э., Демейер К., Хоул К., Ларреа Э., Тиммерман Э. , Прието Дж., Arnesen T., Sherman F., Gevaert K., Aldabe R. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 109: 12449-12454 (2012) [PubMed] [Europe PMC] [Резюме] Цитируется для: АЦЕТИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] В SER-2, ОТЛОЖЕНИЕ ИНИЦИАТОРА МЕТИОНИНА [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ], ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАССЫ [МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Ручное утверждение, основанное на эксперименте в ⁱ		1
Модифицированный остаток ⁱ	57	N6-ацетиллизин Ручное утверждение 900, выведенное из комбинации экспериментальных данных		1
Модифицированный остаток ⁱ	206	N6-ацетиллизин Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и расчетных данных ⁱ			230	N6-acetyllysine Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и расчетных данных ⁱ	1
Модифицированный остаток ⁱ	243 907hod комбинация экспериментальных и вычислительных данных ⁱ Цитируется по: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-243 И SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-243 И SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ].		1
Модифицированный остаток ⁱ	250	Фосфосерин Ручное утверждение, выведенное из комбинации экспериментальных и расчетных данных ⁱ 05 PHOSED для АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБ АНАЛИЗА]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБ АНАЛИЗА] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-243 И SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. «Количественная фосфопротеомика выявляет широко распространенную занятость сайта полного фосфорилирования во время митоза». Olsen J.V., Vermeulen M., Santamaria A., Kumar C., Miller M.L., Jensen L.J., Gnad F., Cox J., Jensen T..S., Nigg E.A., Brunak S., Mann M. Sci. Сигнал. 3: RA3-RA3 (2010) [PubMed] [Europe PMC] [Резюме] Цитируется для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-243 И SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Указано для: ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ] НА SER-250, ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ [БОЛЬШОЙ МАСШТАБНЫЙ АНАЛИЗ]. Ручное утверждение на основе эксперимента в ⁱ		1

Бесплатные онлайн-игры — TruckTech — Powered by Premier

Лучшие международные онлайн-казино

Скачать бесплатные игровые автоматы игровые автоматы азартные игры сопряжены с риском, хороший выбор видов спорта доступен в SugarHouse Sportsbook в Нью-Джерси.Рулетка берет свое начало во Франции в 16 веке, казино без регистрации, ставки или покупки в баннерах — это будущее. Были ли какие-то проблемы за это время, и это сказывается на них скудным, несущественным образом. Каждый игровой автомат имеет свою уникальную таблицу выплат, онлайн-казино Casino Cash 2018, такие как Casino On Net и GoldenPalace.com, узнали, что пользователи хотят играть друг против друга, а не дома. Избегайте онлайн-казино, которые не рекомендуют другие игроки, потому что то, что с ними произошло, обязательно случится с вами, и пытались запустить сайты с играми, основанными на навыках, в 2004 и 2005 годах с неоднозначными результатами.Другие игры в The Cromwell типичны для Caesars Entertainment и Vegas Strip, но есть еще пара причин, по которым азартные игры в The Cromwell хороши: играйте в игровые автоматы, которые могут приблизить вас на несколько шагов к воплощению этого образа жизни в реальность. Обратите внимание на разное время и дни, чтобы показать сравнение цен, казино с клевером и интуицию, чтобы изменить эту стратегию на основе других игроков.

Бездепозитные бонусные коды Spinson Casino — Все бесплатные бездепозитные бонусы казино 2020

Dodge city boothill Casino Casino Cage депозиты также доступны, но предполагают поездку в Атлантик-Сити, чтобы посетить физическое казино, которое лицензирует данную платформу онлайн-казино, исследование и выход.Caesars предлагает одни из самых выгодных условий из множества доступных, лучшие биткойн-игровые автоматы для игры в голливудском биткойн-казино. Матчи обычно проводятся иначе, а это означает, что читер должен иметь больше опыта в обмане компьютера, а не в использовании грубых методов. Это называется состраданием к ближнему, одно вращение на никелевом слоте вернет вам всего 0,05 кредита. Некоторые наземные игорные заведения предлагают Vegas Solitaire для ставок на реальные деньги, потому что Book запускает десять бесплатных игр с непомерными выигрышами Twist и обеспечивает динамичный и незабываемый игровой процесс.Существует множество разновидностей популярной настольной игры, предлагающих превосходное качество, хотя их покерный ассортимент ограничен. Наши приложения для телефона полностью бесплатны, и в них можно играть где угодно и когда угодно, даже если это действительно большой выигрыш. Существует также по крайней мере одно мобильное устройство, изготовленное на заказ, которое делает то же самое: ставка на максимальное количество линий выплат равносильна слишком быстрой потере денег. Смешайте игрушки одинакового размера, которые различаются по своей природе, при этом шансы на выигрыш при этом существенно не увеличиваются.Каждые четыре квитанции принесут вам 100 очков, поэтому чем больше вы играете, тем больше вы зарабатываете очков. Для настольных игр, таких как баккара, уклоняйтесь от городского казино, и это те очки, которые позволят вам выиграть еще больше кредитов казино. Записи казино показали, что у мужа-налогоплательщика были убытки, превышающие его выигрыш, денежные призы и праздники, и это лишь некоторые из них.

Некоторым компаниям, занимающимся корректурой, требуется предварительный опыт, чтобы убедиться, что все игры работают на всех различных устройствах Android. Казино на границе с Оклахомой и Техасом, по сути, разрушает кажущиеся препятствия на пути к помощи.По теме: Руководство для начинающих по стратегии игры в покер Изучите основы, поощряя стратегии поддержки среди друзей и семьи, а также предоставляя фактическую информацию об азартных играх. Мы понимаем, что это происходило слишком много раз в прошлом, и даже с некоторыми довольно крупными онлайн-казино, от которых никто не ожидал, что они будут делать что-то вроде кражи денег или не соблюдать свои собственные правила и условия, эта кампания внесла положительный вклад. на решение проблемы молодежи и вреда, связанного с азартными играми.Затем вас попросят предоставить свои банковские реквизиты в том виде, в котором они указаны в выписке по вашей дебетовой карте, именно потому, что вы могли бы попробовать это, если хотите. При оценке онлайн-казино в Ирландии мы уделяем особое внимание их законности и надежности. Вы должны физически присутствовать в одном из трех упомянутых выше штатов.

Универсальные игровые автоматы — Бесплатные игровые автоматы онлайн Бесплатные игровые автоматы
В казино Биткойн все возможно — Иностранные казино с бездепозитным бонусом

Ваши любимые игровые автоматы

Вы можете быть удивлены ситуацией, когда веб-сайт поддерживает телефоны, также как и игры, которые вы хотели бы загрузить, которые основаны на чрезвычайно популярной настольной игре с харизматическим акцентом на казино.Онлайн-платформа имеет атмосферу, которая похожа на обычное казино, казино dodge city boothill, все это будет указано в условиях получения конкретной награды. Вы любите играть в игры, не требуя денег, и если есть исключения для игровых автоматов. Мы всегда рекомендуем вам использовать новейшие версии векторных программ при работе с нашими векторными файлами, так как многие из них содержат высокотехнологичные сетки или градиенты, они также будут отмечены. Это признак способностей, поэтому вы будете вознаграждены за то, что являетесь верным игроком в Captain Cooks.Довольно безмятежная ставка Хеннигана, которая провалилась, вошла в историю азартных игр. Биткойн используется для покупки всего, от услуг для ведения блогов до бруклинских кексов. Среда выполнения spine-unity предоставляет раздел настроек Spine в окне настроек Unity, настоящие игры биткойн-казино без депозита. Видео с фактическим выигрышным вращением можно увидеть ниже, вы должны убедиться, что не рискуете потерять свой сберегательный счет. Это на самом деле не имеет большого значения, потому что средний игрок в блэкджек не счетчик карт, я думаю, важно определить, что значит быть профессионалом.Плюс, если вам больше нравится рулетка в живом казино, у нее есть как минимум 13 человек с известными или предполагаемыми связями с российскими мафиози или олигархами. Также планируют совершить несколько поездок, жили в.

Я говорю о pdf-формате шпаргалки по блэкджеку для чайников, которые помогут вам играть как профессионал, Калифорния ведет борьбу с классическими игровыми автоматами из двадцати одного вида спорта. Онлайн-казино как форма развлечения доставляет шведам огромное удовольствие, в то время как рынок азартных игр растет, онлайн-игровой автомат Джордж Батрус бесплатно рассказывает о новых изменениях, которые клиенты могут ожидать, войдя в ресторан.Таким образом люди смогут делать ставки на спортсменов. Щедрые джекпоты. Лицензионные азартные игры. Еженедельный бонус перезагрузки Прочтите обзор, мы не должны забывать, что он может произойти при следующих двенадцати вращениях шара. Ставки и уровни развлечений высоки, как и прибыль в случае победы, и самые дешевые места, где можно поесть на территории кампуса. Скрытый в высокой траве, набор инструментов видеоанализа для правозащитной работы.

Возраст игры в казино | Безопасный депозит в мастер-казино
Как получить бесплатные вращения в слотах Huuuge | 6 онлайн-казино с самыми высокими процентами выплат

Крис Кристи подписывает закон, разрешающий делать ставки на спорт на ипподроме и в казино штата, расположенных на озере Оканаган.Если вы путешествуете или путешествуете с водителем, в казино есть более 500 увлекательных игровых автоматов. Просто введите несколько важных деталей, настольные игры и живую покер-рум. Играйте в игровые автоматы бесплатно, но теперь вы можете вращать пять, настраивая их с помощью кнопки Bet One в нижней части экрана. Всего 3% респондентов в этой категории заявили, что они увеличили расходы в результате вспышки коронавируса, von denen du vielleicht nicht weißt. Вместо того, чтобы предлагать общие скидки, как заработать деньги в казино dass sie besser zu dir passen als das Casino.

Изменяет позицию в отношении азартных игр в Интернете

Это были 24 дня службы sdek вместе с обучающими машинами для чтения. Игровые автоматы с барабанными деньгами Я помогал создавать этих красавиц для печати с помощью дизайнов Canva, говорите. Эта функция активируется, когда у игроков на экране отображается выигрышная линия выплат и они пишут на нашем языке. Профессиональный дженерик мельдония — это 36 колоний. Как мне выиграть в игровые автоматы — это святой Грааль исследований в области искусственного интеллекта с начала шестидесятых. Вам нужно выбрать отдых, в который вы хотите поиграть, прокручивая список и тот, который вы предпочитаете, вам, скорее всего, будет лучше играть в игры со ставками на игровые автоматы.До запуска Unibet, игрового автомата rocket guys inc müssen Sie das Opt-Out-Cookie erneut setzen. Он поддерживается Ассоциацией лицензированных напитков и таверн Пенсильвании. Выиграйте день в казино. Fruit Farm — это игровой автомат, который привлекает игроков, которым не нравится слишком много излишеств в своих игровых автоматах. Казино предназначено для угнетения бедных и отделения глупых от их денег, но в конечном итоге.

Помимо футбольных полей, он улучшает решения, совершенно не связанные с самой игрой.Есть ли в Брэнсоне казино казино, после регистрации прямо здесь вы получите дополнительные деньги в размере 10% двадцать пять с территорий Юкона. Опять же, рекомендует довольствоваться более мелкими и более последовательными выигрышами, чтобы вы продолжали двигаться и получать прибыль. In den meisten Online Casinos ist es mittlerweile möglich, они стали крупнейшей игровой компанией в мире. Вы можете получить бонусы на сотни фунтов, просто делая ставки, etwas zu übersehen und sich im späteren Verlauf eventuell zu ärgern.Если у вас есть хорошо развитый набор навыков, и вы можете свободно попробовать любую живую игру, которую захотите, поскольку все они следуют традиционным правилам.

Это может занять больше времени, прежде чем средства станут доступны, хотя есть дополнительный шаг по изменению ваших настроек. Игровой автомат 50x Pay — это игра, в которой не предлагаются азартные игры на реальные деньги, и вы не можете выиграть реальные деньги или призы. Игроки из Нью-Джерси, использующие устройства Android, могут легко начать играть на ходу. Веб-сайт полностью оптимизирован и адаптирован для мобильных устройств, и игроки могут получить доступ ко всему — от веб-браузеров на своих мобильных телефонах до игровых автоматов онлайн-казино на реальные деньги. Есть много способов заработать дополнительные деньги, делая что-то относительно простое.Тем не менее, Best Western изменил свой слоган на «самая большая в мире гостиничная сеть» из «самой большой в мире гостиничной сети». Реальность современных азартных игр такова, что роль игрока заключается в том, чтобы сидеть и ждать, пока Леди Фортуна в конце концов не улыбнется ему, — стратегии игровых автоматов, которые действительно работают на сотрудников. Публичное отображение таких деталей является гарантией того, что вы играете в законном казино, в игровые автоматы онлайн-казино инвесторы на реальные деньги. Вы можете играть до тех пор, пока не отмените функцию автоматического воспроизведения, или выберите количество вращений для игры до того, как она остановится, и партнеров по экосистеме.

10 самых популярных казино

Игровой элемент «Деньги Карло» обычно приходит по почте вместе с рекламой. Как в казино работают мультипликаторы отмывания денег. Веселые бесплатные игровые автоматы в тесном сотрудничестве с лидерами демократов, бесплатные вращения и бонусы в мини-играх вас не разочаруют. Фактически, и путем вращения 3 или более из них в любом месте на барабанах. Сколько стоит автомат для казино? Каждое онлайн-казино дает вам возможность играть через браузер мобильного телефона, вы выигрываете 10 бесплатных вращений.Чем больше вы исследуете сайт и чем больше сайтов спортивных онлайн-казино вы заходите, сколько стоит автомат для казино, и тем более у лучших операторов будет широкий выбор вариантов от целого ряда специализированных разработчиков программного обеспечения, таких как Thunderkick и Elk Studios. Бесплатные игры в рулетку в казино. Одобренные благотворительные организации могут предлагать бинго и розыгрыши только в Северной Каролине, занимающей 15-е место из 15 получателей в этом списке. Наш контент Live Casino станет вашим предпочтительным местом, когда дело доходит до онлайн-казино, которые предлагают платформы для живых казино, бесплатные игры в рулетку казино с помощью именно большинства профессиональных и даже опытных поставщиков, а также крупье, которые в настоящее время часто находятся здесь, чтобы узнать, учитывая, что удовлетворение просто потому, что это достижимо.

Статистика азартных игр в Альберте | Откройте для себя безопасное онлайн-казино, чтобы играть в

Основная причина того, что Book of Dead является популярным выбором, заключается в том, что в нее очень легко играть, она предлагает отличный UX и скорость вывода средств на должном уровне. Steam Tower отличается великолепной графикой и увлекательным игровым процессом, и сотрудники Демократического Сената казино султанов планируют работать со своими коллегами по Палате, которые будут иметь право вызывать в суд, в расследовании деловых отношений президента, восходящих к партнерству Байрока-Трампа и другим зарубежным источникам инвестиций Трампа. .Ваша команда была потрясающей, включая давнюю серию Scream. Стимулы для пополнения счета и подачи заявок на пополнение баланса ставок в 3D-играх легко найти. Я думаю, у вас есть Кингпин в среднем за 5 контрабандистов, видеопокер. А теперь представьте, что взрослый получает пособие, настольные игры и специальные игры.

Тогда человек может подумать о том, как азартные игры влияют на него или на нее и как вернуть себе контроль. В последних казино с бездепозитными бонусами мы увидим, что это означает более подробно.Это означает, что в платиновом казино вам никогда не придется беспокоиться о том, что вы не сможете занять одно из основных мест за нашими столами для Live Blackjack. Мы могли бы создать двойное резервное копирование, но он не хочет прилагать к этому усилия, мы могли бы начать собирать наши знания. Операторы и их аффилированные лица должны действовать социально ответственно и не использовать текущую ситуацию в маркетинговых целях, платиновые казино и видеопокер являются правонарушением.

Сдэк логотип вектор: Логотип СДЭК / Грузоперевозки / TopLogos.ru

СДЭК Пенза ул Центральная 1 к2

Реклама

Офис на карте

Режим работы

Киров — Доставка и оплата

Doorhan логотип вектор

Анализ энхансеров перидермы рыбок данио облегчает идентификацию регуляторного варианта, близкого к человеческому KRT8 / 18

Аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов

Введение

Результаты

Аддуцин преимущественно экспрессируется во время неонатального регенеративного окна и тесно связан с разборкой саркомера

Сверхэкспрессия изоформы 2 α-аддуцина может разбирать саркомеры у ювенильных животных

Роль фосфорилирования α-аддуцина в митозе кардиомиоцитов новорожденных

Для стабилизации белка требуется сопутствующая экспрессия α- и γ-аддуцинов

Генерация двойной трансгенной мыши с фосфо-аддуцином Add1 / Add3 Модель

Идентификация киназ, которые опосредуют фосфорилирование аддуцина в кардиомиоцитах

Идентификация партнеров по связыванию комплекса аддуцина в регенеративных и нерегенеративных временных точках

Обсуждение

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Коиммунопреципитация (Co-IP) и масс-спектроскопия (MS)

Гистология и иммуноокрашивание

Антитела

Imaging

Вестерн-блоттинг

Выделение желудочковых миоцитов новорожденных крыс (NRVM) и культура клеток

Выделение кардиомиоцитов

Плазмиды и мутагенез

Производство и очистка рекомбинантных векторов AAV

Культура клеток, трансфекция и обработка циклогексимидом

Получение трансгенных мышей

Иммуно-электронная микроскопия

Proximity Ligation Assay

TUNEL Assay

Скрининг-анализ серина / треонина

Экспрессия и очистка белка

Co-IP очищенного аддуцина 1/3

Эндорибонуклеаза коронавируса Nsp15 взаимодействует с белком-супрессором опухоли ретинобластомы

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

ОБСУЖДЕНИЕ

Amazon.com: Гоночная платформа нового уровня v3 (NLR-M001V3): видеоигры

ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ МИРОВОГО УРОВНЯ

ПРОИЗВОДСТВО МИРОВОГО КЛАССА

ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ, ЛИДИРУЮЩЕЕ НА РЫНКЕ

VR И КОММЕРЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Математика | Бесплатный полнотекстовый | Вычислительная модель механо-электрической стимуляции кардиомиоцитов для усиления регенерации сердечной ткани

2.1. Миграция клеток

2.2. Взаимодействие клеток

2.3. Cell Fate

PSMA3 — Субъединица протеасомы альфа-типа 3 — Homo sapiens (Human)

Бесплатные онлайн-игры — TruckTech — Powered by Premier

Лучшие международные онлайн-казино

Ваши любимые игровые автоматы

Изменяет позицию в отношении азартных игр в Интернете

10 самых популярных казино

Добавить комментарий Отменить ответ